海洋原核プランクトンの呼吸数と存在量の切り離し

Nature volume 612、pages 764–770 (2022)この記事を引用

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海洋と大気の CO2 交換は、海洋微生物の光合成と呼吸のバランスに大きく依存します。海洋プランクトン性細菌と古細菌 (原核プランクトン) の間には分類学的および代謝上の広大な多様性がある 1,2,3 にもかかわらず、それらの呼吸は通常一括して測定され、地球規模の生物地球化学モデルでは「ブラックボックス」として扱われます 4。これにより、地球規模の炭素循環のメカニズムの理解が制限されます。今回、個々の微生物細胞の表現型解析とゲノム配列を統合した技術を用いて、細胞固有の呼吸速度が原核プランクトン属間で1,000倍以上異なることを示した。呼吸の大部分は、原核プランクトンの少数のメンバー（ロゼオバクタークラスターを含む）によって行われているのに対し、最も普及している系統の細胞（ペラギバクターやSAR86を含む）の呼吸速度は極めて低いことが判明しました。系統間の豊富さから呼吸数が切り離されていること、ペラギバクター細胞および SAR86 細胞におけるプロテオロドプシン転写産物の数の増加、および夜間の SAR86 の呼吸量の増加は、プロテオロドプシンに基づく光栄養 3,5,6,7 がおそらく原核プランクトンにとって重要なエネルギー源を構成していることを示しており、成長効率を高めます。これらの発見は、原核プランクトンのエネルギー需要と成長のための呼吸と植物プランクトン由来の有機炭素のCO2への再石灰化への依存性が一般に想定されているよりも低く、系統間で変動する可能性があることを示唆している。

原核プランクトンの呼吸に対するブラックボックスアプローチは、マイクロオートラジオグラフィー蛍光 in situ ハイブリダイゼーション (MAR) によって示されるように、原核プランクトンのかなりの系統学的およびゲノム的多様性 1,2,3 および系統間の成長と有機基質の取り込み速度の大きな違いを示す圧倒的な証拠とは顕著な対照を示しています。 -FISH)8、FISH ナノスケール二次イオン質量分析 (nanoSIMS)9、および安定同位体プローブ (SIP)10。プロテオロドプシンに基づく光合成 3,5,6 など、ゲノムから予測される代謝プロセスの一部は、原核プランクトンの呼吸や大気中への CO2 放出に直接影響を与える可能性がありますが、その世界的な重要性は依然として十分に制約されていません。今回我々は、原核プランクトン属間で呼吸速度が3桁以上異なることを示す、その場での酸素呼吸速度測定と個々の微生物細胞のゲノム配列を統合する方法を開発した。我々の結果は、蔓延する原核プランクトン系統における呼吸の補完的エネルギー源としてのプロテオロドプシン光栄養性の重要性と、それが地球規模の炭素循環に与える潜在的な影響の証拠を提供するものである。これらの発見は、微生物のゲノムとフェノムを単一細胞解像度で直接結び付ける実現可能性を実証し、海洋原核プランクトンのブラックボックスを生態系モデルにおいて機能的により意味のあるコンポーネントに分割することの重要性を強調しています。

RedoxSensor Green (RSG) は、酸化還元酵素活性に特異的な細胞生存率プローブとして、さまざまな微生物の実験室および環境研究でこれまで使用されてきました 11。 RSG の使用の実現可能性を定量的な方法で評価するために、系統的に多様な水生細菌の純粋培養におけるバルク酸素消費量と単細胞 RSG 蛍光の関係を分析しました (方法論的なワークフローは拡張データ図 1 と補足表に示されています) 1)。定常期細胞はすべての培養物で RSG 蛍光強度が異なり（拡張データ図 2a）、以前の研究と一致する生理学的不均一性を示しています 12、13 が、陰性対照とは異なりました（拡張データ図 2b）。細胞あたりの平均蛍光は、分析範囲内（細胞あたり1時間あたり約1〜1,000 amol O2、R2 = 0.86）の細胞あたりの平均酸素消費速度と相関しており、分類学的偏りの証拠はありませんでした（図1a）。この培養キャリブレーションにより、RSG 蛍光強度を個々の細胞の呼吸数の代用として使用できるようになりました。

a、正規化されたRSG蛍光強度と実験室培養における細胞固有のO2消費速度との比較。各点は 1 つの培養実験 (n = 50) を表し、蛍光値は機器の相互校正に使用される蛍光ビーズ標準に正規化されています。追加の実験の詳細は、補足表 1.b、Winkler 法と細胞特異的 RSG 法を使用して決定されたバルク海洋原核プランクトンの呼吸速度の比較 (n = 12) に示されています。 RSG 法の場合、細胞あたりの平均呼吸数を細胞あたりの呼吸数から計算し、それを使用して 1 ml あたりの RSG 標識細胞数とともに消費された O2 の総量を計算しました。両方のプロットで、回帰直線の周囲の濃い影の領域は 95% 信頼区間を表し、明るい影の領域は 95% の予測区間を表します。

環境研究における呼吸の定量化における RSG の使用を検証するために、我々は、地理的に多様な原核プランクトンサンプルに対して、従来の Winkler 法 14 を使用して、現場条件下で単一細胞 RSG プローブとバルク呼吸測定を同時に実行しました。細胞固有の O2 消費速度は、培養キャリブレーションを使用して計算され (図 1a)、バルク消費速度の推定に使用されました。どちらの手法でも、1 時間あたり 1 リットルあたり 0.008 ～ 2.3 μmol の O2 という分析範囲全体にわたって、同様の O2 消費量の推定値が得られました (図 1b)。これは、RSG が環境環境における微生物の酸素呼吸速度の代用として使用できるというさらなる証拠を提供しました。さまざまな死滅対照サンプルに基づいて、環境サンプルにおける細胞固有の分析検出閾値は、細胞あたり 1 時間あたり約 4 amol O2 であることがわかりました（拡張データ図 3a、b）。フローサイトメトリー分析を使用して定量化できた最低細胞存在量は、1 リットルあたり約 106 細胞でした (参考文献 15)。これは、RSG ベースの微生物群集呼吸測定の理論的な検出限界が 1 リットルあたり 1 時間あたり約 4 pmol O2 であることを意味します。これは、Winkler またはオプトードセンサー検出を使用する標準的な O2 消費アッセイよりも約 4 桁低い値です 14。したがって、RSG アプローチは、現在の方法では感度が不足している低バイオマスおよび/または低活動環境での微生物の呼吸測定を可能にする可能性があります。さらに、RSG プロービングにかかる時間はわずか数分であるため、通常 24 時間以上のインキュベーションが必要な Winkler 測定と比較して、測定の時間分解能が向上し、ボトル影響のリスクが軽減されます4。重要なのは、このアプローチは個々の細胞の分解能で非破壊的な方法で呼吸を独自に測定するため、細胞間呼吸の変動を研究し、それを同じ細胞の他の分析と組み合わせる機会を提供することです。

原核プランクトン系統間の呼吸速度を比較し、それらの測定値を系統のゲノム内容および細胞サイズに関連付けるために、メイン湾沿岸（GoM; 北緯 43.86 度）から収集した 6 つの海洋原核プランクトンサンプルに対して RSG プローブとその後の単細胞ゲノム解析を実行しました。、69.58° W）を2年間にわたって測定しました（補足表2）。単一増幅ゲノム (SAG) は、フローサイトメトリー細胞選別における蛍光源として RSG を追加して、前述の技術 16 を使用して生成および配列決定され、その間に各細胞の光学特性が記録されました。続いて、前方角光散乱強度を使用して各細胞の直径を推定しました16。 2018年10月、2019年4月、2019年7月に収集されたこれらのサンプルのうち3つの細胞特異的RSG蛍光は、上記の培養キャリブレーションを使用して呼吸数に変換されました。機器構成の変更により、2017 年に収集された 3 つの以前のサンプルは同様の方法で分析されましたが、RSG 蛍光を呼吸数に定量的に変換することはありませんでした。

RSGまたは一般的に使用される核酸染色SYTO-9のいずれかでプローブした個々の細胞から同様のゲノム画分を回収し、RSGと下流の単一細胞DNA増幅および配列決定の互換性を実証しました（拡張データ図3c）。 RSG に基づく大量呼吸速度の推定値の範囲は、1 リットルあたり 1 時間あたり 0.35 ～ 0.78 μmol O2 であり、GoM17 および他の沿岸環境での以前の測定結果と一致しています18。個々の細胞の推定呼吸速度は、検出未満（1 時間あたり細胞あたり 0.004 fmol O2 未満）から 1 時間あたり細胞あたり約 145 fmol O2 まで、5 桁以上にわたっていました（図 2a、拡張データ図 4、および補足表 3）。）。呼吸数の実質的な変動は、ほぼ同一のゲノムを持つ細胞間でも発生しましたが、予測平均アミノ酸同一性が約 60% 以上の細胞は、ゲノムの多様性が大きい細胞に比べて呼吸数がより均一であり、現代における属間の境界にほぼ対応していました。原核生物の分類（図2b）。したがって、生物学的に意味のある方法でデータセットを単純化するために、属レベルで SAG をクラスター化しました。

a、2018年10月に収集された個々の原核プランクトン細胞の系統構成、呼吸速度、直径。古細菌にルーツをもつ16S rRNA遺伝子の最尤木が示されている。 0.75 を超えるブートストラップ値は黒丸で示されます。属は灰色と白の陰影で分けられます。この記事で取り上げた属名を示します。培養分離株の参照エントリは赤いアスタリスクで示されます。 b. 同じサンプルから回収された細胞のペアにおけるアミノ酸の同一性と O2 消費の比率の間の関係。黒い線は 1% 間隔の O2 消費率の中央値を示し、灰色の影付きの領域は、下の 10% 分位数と上の 90% 分位数によって境界されます。 c、メタゲノムリードリクルートメントに基づく属特異的な細胞存在量。 d、属固有の細胞あたりの呼吸数。箱ひげ図は、中央値 (中心線)、第 1 および第 3 四分位数 (箱の限界)、および 1.5 × 四分位範囲 (ひげ) を示します。点は、1.5 × 四分位範囲外の外れ値を示します。 e, 各属によって行われる原核プランクトンの呼吸の割合。 c〜eには、最も豊富な10属と群集呼吸に最も大きく貢献した10属が含まれています。灰色の縦線は属を分けています。 c ～ e の色は a で定義されているとおりです。「方法」で説明されているように、属固有の呼吸推定値には、RSG 検出限界を下回る細胞が考慮されていることに注意してください。 c〜eについては、サンプリング日はcの左上に示されており、1日当たりのソートおよび配列決定された細胞の数は、n = 282（2018年10月30日）、n = 274（2019年4月2日）、およびn = 277（9月30日）でした。 2019年7月）。

私たちの結果は、属間の細胞固有の呼吸速度と原核プランクトンの酸素消費への寄与に大きな違いがあることを明らかにしました（図2c〜e）。スペクトルの上限では、ASP10-02a 属 (ガンマプロテオバクテリア)、LFER01 およびプランクトマリナ属 (どちらもロドバクテリウム科、アルファプロテオバクテリアのロゼオバクタークレードのメンバー) には、細胞あたり 1 fmol/h を超える O2 を呼吸する細胞が含まれていました。プランクトマリナは 3 つの時点すべてで総 O2 消費量の 10 ～ 37% を占めましたが、細胞の構成比は 1.2 ～ 2.5% にすぎませんでした。中間呼吸速度が 1 時間あたり細胞あたり 0.01 ～ 1 fmol O2 である細胞は、アミリバクター (ローズオバクタークレード)、バクテロイディアの複数の属、ガンマプロテオバクテリア属チオグロブス、およびいくつかのそれほど豊富ではない属によって支配されていました (拡張データ図 5)。スペクトルの下限では、同定された 303 属のうち 99 属には、細胞あたり 1 時間あたり約 0.004 fmol O2 の検出限界を超える細胞は含まれていませんでした。注目すべきことに、最も蔓延している5つの属のうちの3つは、いかなる時点においても細胞あたり1時間あたり0.03 fmol以上のO2を呼吸する細胞を含まなかった：アルファプロテオバクテリア属ペラギバクターとガンマプロテオバクテリアクラスターSAR86の2つの属（AAA076-P13およびD2472）である。ペラギバクターと SAR86 は、全時点で合わせて全細胞の 22 ～ 24% を構成しましたが、原核プランクトンの総呼吸量の 0.6 ～ 5.6% にすぎませんでした。ペラギバクテリン GoM による平均 O2 消費量の RSG ベースの推定値 (1 時間あたり細胞あたり約 5.0 amol O2) は、定常期培養での以前の測定値 (1 時間あたり細胞あたり約 1 ～ 10 amol O2) と同様でした 19。同様に、Roseobacter クレードと ASP10-02a は、藻類や海岸環境で最も活性な原核プランクトン細胞の中で過剰に存在していることが報告されています 20、21、22。したがって、我々の発見は以前の研究とほぼ一致しており、RSGに基づく単一細胞分析が原核プランクトン分類群間の呼吸速度の違いの現実的な評価を提供することを示唆しています。

細胞固有の呼吸を定量化した3つの実験を考慮すると、最も顕著な季節差は、ガンマプロテオバクテリア属ASP10-02aとフラボバクテリア科（バクテロイディア）のさまざまな属で観察されました（図2c、d）。これらの属は、2019 年 4 月に最も高い細胞特異的呼吸速度と細胞存在量を示しました。同様に、フラボバクテリア科と ASP10-02a は、2017 年の非校正実験では、8 月と 11 月と比較して、4 月の RSG 蛍光と相対的な細胞存在量が上昇していました (拡張データ図6)。この研究の時間分解能は限られていますが、4月の2つの実験がGoMの春の藻類の開花中またはその直後に行われたことは注目に値します（拡張データ図3d）。我々の発見は、Flavobacteriaceae 23、24、25、26 と ASP10-02a21 の両方が藻類の発生に関連しているという以前の報告と一致しています。注目すべきことに、GoM27 では温度と一次生産力に大きな季節差があるにもかかわらず、他のほとんどの原核プランクトン属では、サンプリング日の間で細胞固有の呼吸速度に顕著な差がありませんでした。

私たちは、大西洋と太平洋の地理的に多様な沖合の場所からのサンプルの同様の単細胞呼吸とゲノム分析を実行しました（補足表2）。平均して、これらの貧栄養環境の微生物は、GoM の原核プランクトンと比較して、細胞あたりの呼吸速度が低かった。 GoM と同様に、ペラギバクターや SAR86 を含む最も豊富な系統の多くは、呼吸数が非常に低かった (細胞あたり 1 時間あたり 10 amol 未満の O2) 一方で、O2 消費のほとんどは、存在量の少ない属に起因している可能性があります (拡張データ図と図.7および8）。これらと GoM の結果を総合すると、海洋原核プランクトン分類群間の呼吸速度と細胞存在量が一般的に切り離されていることが示唆されます。

シアノバクテリアを除いて、酸素呼吸と結合した従属栄養性が、表層海洋原核プランクトンの主要なエネルギー源であると一般に考えられています。したがって、最も豊富な原核プランクトン系統のいくつか、特にペラギバクターとSAR86がその場での細胞特異的呼吸速度が極めて低いという我々の発見は不可解である。これは、これらの微生物がどのようにして数的優位性を維持し、プランクトマリナやASP10-02aなどの約100倍高いin situ細胞特異的呼吸速度を持つ属と競合しないのか、また、これらの発見が比較的高いという以前の報告とどのように調和できるのかという疑問を提起する。ペラギバクターによる細胞倍加、タンパク質合成および基質取り込みの in situ 速度 28。

すべてのサンプル収集日と場所にわたって、分析されたすべてのペラギバクター細胞および SAR86 細胞の呼吸数が一貫して低いという我々の発見 (図 2 および拡張データ図 4、7、8、10) は、ペラギバクターの一部の生態型による蔓延する増殖という以前の仮説と矛盾します。地域の状況に合わせて微調整されています29。細胞のサイズが小さいことは、その最小呼吸の部分的な説明を提供する可能性があります。ペラギバクター属、AAA076-P13およびD2472属の細胞の直径は平均約0.3μmでしたが、プランクトマリナ属、アミリバクター属、LFER01およびASP10-02aの直径は平均0.5〜0.8μmでした（補足表4）。細胞の形状が類似していると仮定すると、直径の 2 倍の違いは、生体体積の 8 倍の違いに相当します。これはかなりの量ですが、細胞固有の呼吸速度のはるかに大きな差異を説明するには十分ではありません。さらに、細胞の体積と呼吸数の間には弱い相関関係しか観察されませんでした（図3a）。代わりに、RSGベースの呼吸速度は、ゲノムが予測した最小倍加時間30とより強く相関しており、分析されたGoMサンプルでは多くの属の増殖速度が理論上の最大値に近かったことを示唆しています30（図3b）。興味深いことに、呼吸と属間のウイルス DNA を含む細胞の頻度との間に相関関係は見られず、また、ウイルスを含む細胞の割合が高い日（2018 年 10 月）と低い日（2019 年 7 月）の間で SAR86 呼吸数に差は見られませんでした（拡張データ図3e)、ファージと宿主の相互作用が細胞特異的な原核プランクトンの呼吸速度に大きな影響を与えることに反対しています。

a、加重平均 O2 消費率対生物量。 b、加重平均 O2 消費率と最小倍加時間。 c、生物体積対16S rRNA遺伝子転写物の数。 d、加重平均O2消費率対16S rRNA遺伝子転写物の数。 e、加重平均 O2 消費率対 mRNA 転写物の数。 a ～ d について、各データポイントは、属およびフィールドサンプルごとに計算された平均値を表します。実線は回帰を示し、点線は中央値を示します。「方法」で説明されているように、重み付けされた O2 消費率には、RSG 検出限界を下回る細胞が考慮されていることに注意してください。

GoM 原核プランクトンの生理機能についてさらなる洞察を得るために、分析されたサンプルのうちの 4 つから定量的なメタトランスクリプトームデータセット 31 を生成しました。個々のリードは参照データベース 3 として GoM SAG を使用して注釈が付けられ、細胞ごとの転写物に対して正規化されました。細胞あたりの mRNA および 16S rRNA 遺伝子転写物の全体の平均数は 36 および 426 であり、これは沿岸原核プランクトンに関する以前の報告と同様です 32。しかし、我々の研究では、これらの数は原核プランクトンの属によって大きく異なり、mRNAの場合は細胞あたり5～144個、rRNAの場合は細胞あたり48～2,480個の範囲であることが示されました。細胞サイズとrRNA転写物のコピー数の間に相関関係が観察されましたが（図3c）、細胞固有の呼吸速度と時々使用されるrRNAまたはmRNA分子の数の間には有意な相関関係はありませんでした（図3d、e）。代謝活動の代理として。さらに、生物体積当たりの rRNA の数は属間で比較的均一であり、ペラギバクターとプランクトマリナの間ではわずか 3 倍の違いしかありませんでした。これは、リボソームおよび総 mRNA 分子数は細胞呼吸の指標としては不十分であり、呼吸以外のエネルギー生成プロセスが GoM 原核プランクトンの代謝に重要である可能性があることを示唆しています。

プロテオロドプシンに基づく光栄養性は、ATP 合成の補完的な供給源であり 35、そのコード化の可能性は、ほとんどの GoM 属を含む海洋原核プランクトン 3,5,6,7 に広く普及しています (補足表 4)。したがって、一部の原核プランクトン系統は、エネルギー源として従属栄養プロセスと光栄養プロセスの組み合わせに依存する混合栄養系統である可能性があります。地中海における色素分布に関する最近の研究では、プロテオロドプシンがクロロフィル a と同量の太陽エネルギーを捕捉しており、これは平均的な原核プランクトン細胞の基礎代謝を維持するのに十分である可能性があることが示されました 36。ペラギバクターおよびその他の表層海洋原核プランクトンの主要なグループが単純な有機化合物を消費することはよく知られていますが、プロテオロドプシン由来の ATP を利用できると、呼吸ではなく生合成におけるこれらの分子の使用が増加し、したがって成長効率が向上する可能性があります 19,38。、39。しかし、現場および海洋の生物地球化学プロセスにおける原核プランクトンの細胞エネルギー学におけるプロテオロドプシンの重要性を示す直接的な証拠は不足しています5,6。ここで、ペラギバクターやSAR86など、細胞サイズが小さいにもかかわらず、プロテオロドプシン転写物の細胞あたりの数は、検出可能な呼吸速度が最も低い分類群の中で最も高いことを発見しました（図4a）。ペラギバクターおよび SAR86 のゲノムと代謝が極端に合理化されていることを考えると 37、豊富なプロテオロドプシン転写物は、これらの主要な原核プランクトン系統に対する光栄養性の重要性を強く示しています。

a, 属間の細胞特異的呼吸速度とプロテオロドプシン転写物数との関係。各データポイントは、属と単一のフィールドサンプルを表します。色と形状は図 3.b に定義されているとおりです。原核プランクトンのプロトン勾配と ATP の生成における呼吸とプロテオロドプシンの光栄養性の相補的役割の概略図。 c、d、2021年8月の夜間（c）および日中（d）にGoMで収集された個々の原核プランクトン細胞の細胞サイズ、呼吸速度および分類学的所属。「方法」で説明されているように、属固有の呼吸推定値には、RSG 検出限界を下回る細胞が考慮されていることに注意してください。

これまでの研究では、トランスポーター 40 やプロテオロドプシン 41 の遺伝子発現の日周サイクルなど、原核プランクトンの昼と夜での代謝の違いが実証されています。上記の RSG 実験はすべて、プロテオロドプシンの転写物数が最も多くなる可能性がある午前中に実施されました 41。プロテオロドプシンの光栄養性が呼吸数に及ぼす潜在的な影響を調べるために、私たちは2021年8月の昼夜にGoM原核プランクトンに対して追加のRSGプロービングと単細胞ゲノミクス実験を実施しました。私たちは、偏性従属栄養生物は、藻類が活動する日中に呼吸数を増加させるという仮説を立てました。光合成は不安定な有機基質の利用可能性を高めます。対照的に、シアノバクテリア以外の原核生物の光栄養生物は、プロテオロドプシン駆動のプロトンポンプの欠如を補うために、夜間により多く呼吸すると予想される可能性があります（図4b）。最初のシナリオと一致して、UBA10364属（バクテロイドタ属、フラボバクテリアレス属）は、夜間と比較して日中の方が高い呼吸数を示しました（図4c、d、拡張データ図9および10）。対照的に、AA076-P13 (SAR86) の呼吸数は、日中と比較して夜間の方が 6 倍高かった (1 時間あたり細胞あたり 52 対 8 amol O2) (マン・ホイットニー U 検定、P < 0.05; 拡張データ図 9)および 10) は、この属のエネルギー代謝に対する光合成の潜在的な影響を示唆しています。 SAR86 系統は、呼吸によって生成されるエネルギーを補うために使用する可能性のある、多様なプロテオロドプシン遺伝子セットを持っていることが以前に示されています 42,43。 AA076-P13の日中の呼吸が1時間当たり細胞当たり44amol O2減少したことは、プロテオロドプシン駆動のプロトン勾配を使用して同等の量のATPが生成された可能性があることを示唆しています。しかし、ペラギバクターの呼吸は昼も夜も同様で、1 時間あたり細胞あたり約 5 amol の O2 でした。私たちの実験では、原核プランクトンのエネルギー源に対するプロテオロドプシンの光栄養性の完全な影響が複数の要因で隠蔽されている可能性があります。その中には、(1) 日中の光合成産物による呼吸の刺激。 (2) ペラギバクター 37 を含むいくつかの属の代謝を調節する能力が限られている。 (3) 成長効率が変動する。 (4) この実験の規模が小さいため、統計的検出力が不十分です。プロテオロドプシン駆動のプロトンポンプによる群集全体の平均影響は、12 ヘクタール、1 細胞あたり 1 時間あたり 44 アモルの O2 に相当するという推測的な仮定を立てることにより、GoM 原核プランクトンがプロテオロドプシンを使用して、生成される ATP と同等の ATP を生成していると推定できます。 1 日あたり 1 リットルあたり 0.5 μmol の O2 で、原核プランクトンの総呼吸量よりも 1 桁少ない量です。プロテオロドプシンの光栄養性の重要性は、貧栄養な沖合環境でははるかに大きくなると予想されます38。そこでは、ほとんどの原核プランクトン細胞（拡張データ図7および8）とプロテオロドプシンの呼吸速度が細胞あたり1時間当たり10 amol未満のO2未満であることが一般的です。クロロフィルa36に匹敵する量の太陽光を吸収する可能性があります。生産地域では、プロテオロドプシン由来のATPへの比較的一定したアクセスにより、原核プランクトンに対する植物プランクトンの生産性の季節差の影響が緩和される可能性があり、GoMの原核プランクトン組成の限られた季節性の説明に役立ちます（図2c〜eおよび拡張データ図4）。

個々の未培養細胞の統合ゲノムおよび表現型分析により、海洋原核プランクトン属間で細胞固有の呼吸速度が1,000倍以上異なることが明らかになった。私たちは、呼吸の大部分は比較的稀な系統によって行われているにもかかわらず、最も豊富に存在する原核プランクトン分類群の呼吸速度が極めて低いことを発見し、その競争上の優位性の源泉に疑問を投げかけています。呼吸数と系統の存在量の分離、低呼吸細胞におけるプロテオロドプシン転写産物の数の増加、および一部の低呼吸分類群の夜間の呼吸上昇は、プロテオロドプシンに基づく光合成が主な細胞の成長効率と生産性を向上させる可能性があることを総合的に示しています。原核プランクトン群は、栄養素の摂取のためのエネルギーを提供するか、生体分子の生合成を促進することによって、その後の海洋表層の炭素とエネルギーのフラックスに影響を与えます。

メーカー (Thermo Fisher Scientific) によると、酸化還元酵素は生細胞内で RSG を緑色蛍光生成物に変換し、顕微鏡またはフローサイトメトリーを使用して定量できるとのことです。機能的に類似しており、以前に利用されていたテトラゾリウムプローブ CTC44 と比較して、RSG は優れた蛍光スペクトル特性を持ち、インキュベーション時間が短く、既知の毒性作用がありません 11。 BacLight RedoxSensor Green Vitality Kit のマニュアル (Thermo Fisher Scientific) では、細胞分析に進む前にサンプルを RSG と 10 分間インキュベートすることを推奨しています。海洋原核プランクトン細胞の存在量と蛍光強度に対する培養期間の影響をテストするために、2016 年 8 月 11 日に沿岸の GoM (北緯 43.8609 度、西経 69.5782 度) から収集した海水でテストを実施しました。 2 つの反復した表層海水サンプルが収集されました。滅菌した 50 ml ポリプロピレンチューブに入れ、さらなる処理のためにその場温度で研究室に輸送しました。これらのサンプルは、メーカーの推奨濃度の RSG (最終濃度 1 μM) で修正され、暗所でその場温度でさまざまな時間インキュベートされてから、装備された BD Influx Mariner フローサイトメーター (Becton Dickinson、旧 Cytopeia) を使用して分析されました。励起には 488 nm レーザー、70 μm のノズルオリフィスを使用します。 RSG 陽性細胞は、粒子の緑色蛍光 (531/40 バンドパス)、前方散乱、および緑色蛍光と赤色蛍光の比 (692/40 バンドパス; 砕片粒子からの細胞の識別を向上させるため) に基づいてゲートされました。 RSG陽性細胞の存在量と蛍光強度の両方が最大値に達し、30〜70分のインキュベーション後も安定したままであることがわかりました（拡張データ図3f）。これらの結果に基づいて、その後の RSG インキュベーションを 30 分間に設定しました。

表現型が異なる種、Shewanella loihica45、Roseobacter denitrificans46、Pseudomonas stutzeri47、Ruegeria pomeroyi48、および Vibrio alginolyticus49 の分離株は、国立海洋藻類微生物叢センターから入手されました。 Rhodoluna lacicola50 および Oligotropha carboxidovorans51 の分離株は、ドイツ微生物および細胞培養コレクションから入手しました。培養物は、ブチルゴム栓で密閉した70 mlガラス血清バイアル中で、ヘッドスペースに大気を入れて（開始O2濃度21％）、さまざまな温度と栄養素濃度（培地レシピと増殖条件は補足表1に記載）の特定の培地で増殖させました。培養培地と容器のヘッドスペース間の完全なガス交換を促進する回転振盪テーブル。個別の時点で少量の液体を抜き出す必要があるため、ヘッドスペースアプローチが使用されました。

すべての培養容器内の酸素濃度は、製造元の指示に従って Firesting-O2 光学メーターを使用して測定されました (PyroScience センサー技術)。各血清ボトルについて、分析対象の培養物と同じ温度に保たれた別のボトルのヘッドスペース（液相に海水がある）にも温度正規化プローブを挿入し、オプトードプローブをヘッドスペースに挿入しました。酸素濃度はヘッドスペースで測定され、培地と培養ヘッドスペースの間の完全なガス平衡を仮定し（すべての培養物が回転シェーカーテーブル上に保持されたため）、温度とヘッドスペースを考慮して、培地中の溶存酸素濃度に変換されました。培地の圧力と塩分52．この変換は、オプトードプローブの先端で O2 を直接測定する Firesting-O2 オプトード法により可能でした (つまり、この方法では O2 の拡散や消費がありません)。ヘッドスペース内の O2 を測定した後、培地中に存在する濃度はヘッドスペース平衡化技術を使用して計算され、海面での一定の大気圧における温度と塩分を考慮した O2 のブンゼン係数 54,55 を使用して計算されました 53。各培養タイプの推定倍加時間に基づいて、培養培地中の O2 濃度を数時間ごとに測定しました。各培養物の O2 濃度の測定は、初期接種から対数増殖期、定常期に達するまでの範囲にわたって行われました。微生物細胞存在量の操作上の変化は、分光光度計を使用した波長 600 nm での光学密度の測定に基づいて決定されました。 O2 濃度が指数関数的に減少しなくなり、細胞存在量が指数関数的に増加しなくなった場合、培養物は定常期にあると判断されました。定常期中、O2 呼吸速度は、測定間の O2 濃度の時間正規化された差として計算されました。平均的な細胞あたりの O2 呼吸速度を推定するために、以下に説明するように、O2 濃度の測定と同時に採取した培養材料のサブサンプルのフローサイトメトリー分析によって微生物細胞の存在量を決定しました。

培養物が定常期に達した後、滅菌針とシリンジを使用して 1 ml のサブサンプルを採取し、2 ml クライオバイアルに移し、1 μl の RSG ストック溶液で修正しました。穏やかに混合した後、凍結バイアルをソース培養物と同じ温度で 30 分間インキュベートしました。次に、凍結バイアルを 5% グリセロールおよび 1 × pH 8 Tris-EDTA 緩衝液 (最終濃度) で修正し、液体窒素中で急速冷凍し、下流のフローサイトメトリー分析で使用するまで -80 °C で保存しました。 RSGでインキュベートしたサンプルを採取した後、培養物がまだ定常期にある間に、10mlの培養物と培地を121℃で30分間オートクレーブすることによって、各培養タイプの死滅対照を調製した。接種されていない培地および死滅させた対照のサンプルも、下流フローサイトメトリー分析のための適切なゲートを決定する際に使用するために採取されました。

解凍後、凍結保存されたサンプルを ZE5 Cell Analyzer フローサイトメーター (Bio-Rad) を使用して分析しました。サンプルは青色励起 (488 nm) で分析され、装置は 525/35 nm バンドパスフィルターを使用して前方散乱と緑色蛍光の両方でトリガーされました。分析ゲートは、パーティクルグリーン (RSG) 蛍光と直角側方散乱に基づいて定義されました。分析ゲートは、未接種の培地ブランクから非細胞粒子ノイズのみを含む領域を除去するように、また死細胞 (オートクレーブによって死滅した) を含む領域を除去するように設定されました。すべての培養サンプルについて、増殖する細胞の領域が明確に定義されました (拡張データ図 2b)。細胞存在量と緑色蛍光は、FlowJo v.10.6.2 (Becton Dickinson) で分析されました。

ZE5 Cell Analyzer フローサイトメーター (Bio-Rad) と BD Influx Mariner フローサイトメーター (Becton Dickinson、旧名 Cytopeia) のサイトメトリー機器と設定の間の日々のドリフトと差異を考慮して、細胞のグリーンを正規化する手順が開発されました。 2 つの蛍光粒子サイズ標準キット: NFPPS-52-4K または RCP-30-5A (Spherotech) のいずれかを使用した蛍光。これらのビーズは、同じ機器と設定を使用して、RSG 標識細胞を分析するときに毎日フローサイトメトリーを使用して分析されました。各ビーズについて、525/35 蛍光の幾何平均を FlowJo を使用して計算しました。 NFPPS-52-4K ビーズキットの場合、最も蛍光の少ないビーズには 1 に等しい正規化蛍光値が割り当てられ、他のビーズの正規化蛍光値 (補足表 5) は、ビーズに対する蛍光の平均比として計算されました。最も蛍光の少ないビーズの蛍光。これらの比率の平均は、この技術を複数日に適用して推定されました。

野外および培養サンプルの毎日の分析について、測定されたビーズの蛍光とそれらの正規化された蛍光値との間の関係を確立するために線形回帰が実行されました。次に、各細胞の正規化された蛍光が次のように推定されました。

ここで、x は細胞の測定された蛍光、m は細胞分析日から実験的に決定されたビーズ線形回帰の傾き、b は細胞分析日から実験的に決定されたビーズ線形回帰の切片です。

2 つのビーズセットを相互校正するために、BD Influx Mariner フローサイトメーターで複数日に渡ってフローサイトメトリーで共分析し、上記の線形回帰式を使用して各 RCP-30-5A ビーズの幾何平均の正規化蛍光を計算しました。標準化された正規化蛍光値は、複数日の RCP-30-5A ビーズの幾何平均を平均することによって計算されました (補足表 5 (列 RCP-30-5A))。 RCP-30-5A ビーズの標準化された正規化蛍光を使用して線形回帰分析を実行し、測定されたビーズ蛍光と NFPPS-52-4K ビーズが使用されなかった日の正規化蛍光 (上記を参照) との関係を確立しました。利用可能。

続いて、微生物培養物の正規化された蛍光をその平均呼吸数と相関させたところ（図1a）、次のような指数関数的な関係が得られました。

ここで、細胞呼吸は、1 時間あたりの細胞あたり fmol O2 で表した細胞固有の呼吸推定値であり、正規化蛍光は細胞の正規化 RSG 蛍光です (上記を参照)。この方程式は、解釈を容易にするために図 1a に変換されています。

呼吸の定量化における RSG の使用を検証するために、地理的に多様な沿岸および外洋の原核プランクトンサンプルに対して、従来の Winkler 法 14 を使用して、現場条件下で RSG プローブとバルク呼吸測定を同時に実行しました (補足表 2)。 GoM サンプルの場合、海水は、1 つのサンプル (ダマリスコッタ川) を除き、上記の RSG サンプルと同じ場所でニスキンボトルを使用して深さ 1 m で収集されました。その場所は補足表 2 に示されています。収集され、40 μm メッシュフィルターを通過し、ヘッドスペースなしで 8 つの生物学的酸素要求量 (BOD) ボトルを充填するために使用されました。気泡を避け、容器に移す際に水が大気と行うであろう追加のガス交換を省略するために、各フラスコをその体積の少なくとも 3 倍オーバーフローさせました。これらのボトルのうち 4 つはすぐに固定され 56、残りの 4 つのボトルは固定前に暗所でその場温度で 24 時間インキュベートされました 56。すべてのボトル内の酸素濃度は、電流滴定装置 56 を使用して分析されました。

外洋サンプルはニスキンボトルから BOD フラスコに直接収集されましたが、地中海沿岸サンプルは海岸からバケツを使用して収集され、酸洗浄されたポリカーボネート製カーボイに移されました。実験室に到着した地中海沿岸の水を 0.8 µm のポリカーボネートフィルターでろ過し、BOD フラスコに移しました。各フラスコは少なくともその体積の 3 倍がオーバーフローしました。 3 つの複製 BOD フラスコを直ちに固定し、別の 3 つのフラスコを暗所でその場温度で 24 時間インキュベートしました。 Winkler 化学薬品で固定した後、サンプルは電位差法 56 (地中海沿岸および北大西洋) または分光測光法 57 (南および赤道大西洋) を使用して測定されました。ウィンクラーに基づく原核プランクトンの呼吸速度は、最初と最後のサンプル間の溶存酸素濃度の差として推定されました。

野外サンプルを収集した直後、サブサンプルは、暗所でその場温度で RSG とともに 30 分間インキュベートされ、その後、フローサイトメトリー分析と上記の細胞固有の呼吸数の推定まで -80 °C で保存されました。 RSG ベースのバルク呼吸速度は、平均の細胞固有の呼吸速度 (上記) に各サンプル中の呼吸している細胞の存在量を乗じることによって得られました。

主な研究では、2017年4月から7月までの6日間、ダマリスコッタ川（北緯43.8609度、西経69.5782度）の河口にあるイーストブースベイの海岸にあるビゲロー海洋科学研究所のドックから、GoMからのサンプルが収集されました。 2019年（補足表2）。水サンプルは、5 l ニスキンボトルを使用して深さ 1 m から収集され、50 μm メッシュフィルターを通過し、酸で洗浄されたポリカーボネートボトルに移され、その場温度で研究室に輸送され、すぐに処理されました。外洋サンプルはCTDロゼットに取り付けられた12リットルのニスキンボトルで収集され、酸で洗浄されたポリカーボネートボトルに移されました。続いて、2 つの 1 ml 海水サブサンプルを冷凍バイアルに移し、1 μl RSG (最終濃度 1 μM) で修正し、暗所でその場温度で 30 分間インキュベートし、5% グリセロールおよび 1 × pH 8 TRIS-EDTA 緩衝液で修正しました。 (最終濃度)、液体 N2 中で急速冷凍し、-80 °C で保存。すべての場合において、追加の 1 ml の海水サブサンプルを 5% グリセロールおよび 1 × pH 8 TRIS-EDTA 緩衝液 (最終濃度) で修正し、液体 N2 中で急速冷凍し、RSG を添加せずに -80 °C で保存しました。

昼と夜の条件を比較するために、2021 年 8 月 24 日 (14:00 EST) と 25 (02:00 EST) に、上記と同じ手順に従ってビゲロー研究所のドックから追加の GoM 海水サンプルが収集されました。 1 ml サンプルのアリコートを 3 回繰り返します上述のように、ＲＳＧで標識し、凍結保存した。

呼吸している細胞の選別には、上記のように野外で RSG で標識したサンプルを使用しました。原核プランクトン細胞の非特異的選別では、凍結保存および解凍した海水サンプルを SYTO 9 核酸染色液 (最終濃度 5 µM、Thermo Fisher Scientific) とともに氷上で 10 ～ 60 分間インキュベートしました。フローサイトメトリー分析および分類は、励起用の 488 nm レーザーおよび 70 μm ノズルオリフィスを備えた BD InFlux Mariner フローサイトメーター (Becton Dickinson、旧 Cytopeia) を使用して実行されました。サイトメーターは、ほとんどの場合前方散乱光でトリガーされ、2021 年 8 月には緑色蛍光でトリガーされました。ソート純度を最大限にするために「シングル 1 ドロップ」モードが使用されました。ソートゲートは、粒子の緑色蛍光 (核酸含有量または呼吸速度のいずれかの代用)、前方散乱光 (細胞直径の代用)、および緑色蛍光と赤色蛍光の比 (砕片粒子からの細胞の識別を向上させるため) に基づいて定義されました。細胞を、ウェルあたり600 nlの1×TEバッファーを含む384ウェルマイクロプレートに置き、さらなる処理まで-80℃で保存した。 384 ウェルのうち、317 ウェルは単一細胞専用で、64 ウェルはネガティブコントロール (液滴付着なし) として使用され、3 ウェルにはそれぞれ 10 個の細胞を受け入れてポジティブコントロールとして機能しました。マイクロプレートウェルへの液滴付着の精度は、直径 3.46 μm の SPHERO レインボー蛍光粒子 (Spherotech) を選別し、顕微鏡を使用して各ウェルの底に存在するかを検査することにより、選別日ごとに数回確認されました。これらの検査では、ビーズを含まないウェルは 2% 未満であり、複数のビーズを含むウェルは 0.4% 未満でした。

インデックスソートデータは、BD Sortware ソフトウェアを使用して収集されました。以下の実験室培養物を細胞直径等価検量線の作成に使用しました。マイクロバクテリウム属; ペラギバクター・ユビク HTCC1062; これらの培養物の平均細胞直径は、Multisizer 4e Coulter Counter (Beckman Coulter) を使用して測定されました。 4 つの培養物それぞれの平均前方散乱は、環境サンプルの選別中に使用されたのと同じフローサイトメトリー設定を使用して決定され、単一細胞選別の毎日繰り返されました。これらの培養物では、細胞直径と前方散乱光 (FSC) の間に強い相関関係があることが観察されました 16。この相関関係を利用して、ソートされた環境細胞の推定直径 (直径、μm) が対数線形回帰モデルから推定されました。

ここで、a と b は毎日の選別から経験的に導出された回帰係数 16、FSC は測定された前方散乱値です。この計算は、すべてのフローサイトメトリー細胞選別セッションで繰り返されました。代理細胞の体積は、すべての系統について球形を仮定して計算されました。

ゲノム DNA 増幅の前に、細胞を溶解し、2 回の凍結融解サイクルと、0.4 M KOH、10 mM EDTA、および 100 mM ジチオスレイトールからなる溶解バッファー 700 nl の添加、およびその後の 10 分間のインキュベーションによって細胞の DNA を変性させました。 20℃。溶解は、700 nlの1 M Tris-HCl、pH 4の添加により終了させた。WGA-X16を使用して単一細胞全ゲノム増幅を実施した。簡単に説明すると、10 µl WGA-X 反応には、最終濃度 0.2 U µl-1 Equiphi29 ポリメラーゼ (Thermo Fisher Scientific)、1 × Equiphi29 反応バッファー (Thermo Fisher Scientific)、各 0.4 µM dNTP (New England BioLabs)、10 µM が含まれていました。ジチオスレイトール (Thermo Fisher Scientific)、2 つの 3' 末端ホスホロチオエートヌクレオチド結合を持つ 40 μM ランダムヘプタマー (Integrated DNA Technologies)、および 1 μM SYTO 9 (Thermo Fisher Scientific)。これらの反応は 45 °C で 12 ～ 16 時間実行され、その後 75 °C で 15 分間インキュベートされて不活化されました。 WGA-X 反応が非標的 DNA で汚染されるのを防ぐために、すべての細胞溶解試薬と DNA 増幅試薬は Stratalinker (Stratagene)58 システムで紫外線で処理されました。反応を不活化することなく、検出可能なすべての汚染物質を架橋するために必要な紫外線照射の長さを決定するために、紫外線照射の経験的な最適化が実行されました。細胞の選別、溶解、および WGA-X のセットアップは、クラス 1000 クリーンルーム仕様に準拠した HEPA フィルター環境で実行されました。細胞を選別する前に、機器、試薬、作業スペースは紫外線照射と次亜塩素酸ナトリウム溶液を使用して DNA を除染しました 59。 DNA 汚染のリスクをさらに軽減し、精度とスループットを向上させるために、Bravo (Agilent Technologies) および Freedom Evo (Tecan) ロボットリキッドハンドラーを 384 ウェルプレート内のすべてのリキッドハンドリングに使用しました。

SAG ゲノム配列決定用のライブラリーは、カラムクリーンアップキット (QIAGEN) を使用して実行された精製ステップと、BluePippin (Sage Science) を使用して実行されたライブラリーサイズ選択を除き、メーカーの指示に従って Nextera XT (Illumina) 試薬を使用して作成されました。 ) ターゲットサイズは 500 ± 50 bp です。 DNA 濃度測定は、Quant-iT dsDNA アッセイキット (Thermo Fisher Scientific) を製造業者の指示に従って使用して実行しました。ライブラリーは、2 × 150 bp モードの NextSeq 500 (Illumina) システムまたは 2 × 100 bp モードの NextSeq 2000 (Illumina) システムのいずれかを使用してシーケンスされました。取得したシーケンスリードは、Trimmomatic (v.0.32)60 を使用して次の設定を使用して品質トリミングされました: -phred33 LEADING:0 TRAILING:5 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36。ホモ・サピエンス参照アセンブリ GRCh38 および WGA-X 試薬汚染物質のローカルデータベースと一致するリード 16 (100 bp 以上のアライメントの 95% 以上の同一性) および低複雑性のリード (ヌクレオチドが 5% 未満を含む) は削除されました。残りの読み取りは、kmernorm v.1.05 (http://sourceforge.net/projects/kmernorm) の設定 -k 21 -t 30 -c 3 を使用してデジタル正規化され、次に SPAdes (v.3.0.0)61 でアセンブルされました。以下の設定: --careful --sc --phred-offset 33. 取得したコンティグの両端を 100 bp ずつトリミングし、2,000 bp より長いコンティグのみを保持しました。 H. sapiens 参照アセンブリ GRCh38 および WGA-X 試薬汚染物質のローカルデータベースに一致するコンティグ 16 (100 bp 以上のアライメントの 95% 以上の同一性) が削除されました。得られたゲノムアセンブリの品質は、CheckM (v.1.0.7)62 および四量体頻度分析 63 を使用して決定されました。このワークフローは、ゲノムの複雑さと GC の割合が異なる 3 つの細菌ベンチマーク培養を使用してアセンブリエラーについて評価されました。アセンブリ内に非ターゲットおよび未定義の塩基がないこと、および 100 kb あたりのミスアセンブリ、インデル、およびミスマッチの平均頻度が以下であることが示されました: 1.5、3.0、およびそれぞれ5.0（参考文献16）。潜在的に汚染された DNA 配列が検出された 153 個の SAG はデータセットから削除されました。これにより、7,518 個の厳選された SAG ゲノムアセンブリが得られました。

ペアごとの SAG 平均アミノ酸同一性は、CompareM64 を使用して推定されました。 500 bp を超える 16S rRNA 遺伝子領域は、CREST 65 の厳選された SILVA 参照データベース SILVAMod (v.128)66 に対して BLAST によって提供されたローカルアライメントを使用して同定され、CREST の最後の共通祖先アルゴリズムの再実装を使用して分類されました。系統樹は、最初に SINA アライナー (v.1.2.11) を使用してアラインメントを作成し、次に MEGACC (v.10.2.4) で最尤系統関係を推論することにより、ほぼ完全 (>1,400 bp) SAG 16S rRNA 遺伝子から生成されました。 100 ブートストラップで 68。木には注釈が付けられ、iTOL69 で視覚化されました。 SAG の分類学的割り当ては、GTDB-Tk (v.1.4.1)70 を使用して取得されました。

機能アノテーションは、ソフトウェアによって提供されるデフォルトの Swiss-Prot データベースを備えた Prokka71 を使用して最初に実行されました。 Prokka は、古細菌と細菌の Swiss-Prot72 エントリをコンパイルして構築されたカスタムタンパク質アノテーションデータベースを使用して 2 回目に実行されました。分類学的割り当ては GTDB-Tk (v.1.4.1)70 を使用して取得されました。ウイルス配列 (全体または部分コンティグ) は、3 つの既存のバイオインフォマティックウイルス同定ツール、ViruScope73 (virus_prob > 0.95)、VirSorter274 (カテゴリー 1 および 2 のみ)、および DeepVirFinder75 (P > 0.95) を使用して個別に同定されました。これら 3 つのツールの結果が結合されました。偽陽性 (P < 0.95) は CheckV76 を使用して除去されました。

100 ～ 200 ml の海水アリコートからの微生物バイオマスを真空濾過 (最大圧力 15 psi) によって Supor 0.2 μm 滅菌フィルター (Pall Corporation) 上に収集し、液体窒素中で急速冷凍し、核酸抽出まで -80 °C で保存しました。。 MTST5 および MTST6 RNA 標準は、前述のように RNA 抽出前に推定総収量 0.1 ～ 1% の濃度になるように各フィルターに添加されました 31。 Zymobiomics DNA/RNA Miniprep キット (Zymo Research) を使用して DNA と RNA を並行して抽出し、さらに処理するまで -80 °C で保存しました。 RNA サンプルは、RNA Clean & Concentrator キット (Zymo Research) を使用してさらに洗浄および濃縮されました。 Illumina ショットガンシーケンシング用の cDNA ライブラリは、KAPA RNA HyperPrep (Roche Sequencing) を使用して生成されました。 DNA ショットガンシーケンス用のライブラリは、Nextera XT キット (Illumina) を製造業者の指示に従って使用して生成しました。両方のライブラリタイプを、370 bp に「タイト」に設定した BluePippin (Sage Science) を使用してサイズ選択し、Tapestation (Agillent) を使用して定量しました。これらのライブラリーは、NextSeq 500 (Illumina) システムを 2 × 150 bp モードで使用して配列決定されました。

シーケンス後、RNA ライブラリと DNA ライブラリの両方からのリードを最初に Trimmomatic でトリミングしました (設定: -phred33 LEADING:0 TRAILING:5 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:75)。 H. sapiens 参照アセンブリ GRCh38 および WGA-X 試薬汚染物質のローカルデータベースと一致するリード 16 (100 bp 以上のアライメントの 95% 以上の同一性)、および低複雑性のリード (ヌクレオチドが 5% 未満を含む) が削除されました。残りの読み取りは、k = 40、extend2 = 60、iterations = 5、loose='t'、qtrim2='t' の設定を使用して bbmerge でマージされました。マージされたリードは、前述のように基礎となる参照ゲノムデータベースをこの研究の SAG に置き換えた後、Kaiju 分類子 77 を使用して分類学的および機能的に注釈が付けられました 3。 SSU rRNA 遺伝子転写物を同定するために、Bowtie278 を使用してメタトランスクリプトームリードを SILVA SSU ライブラリー 66 (v.132) 上にリード長全体にわたって 95% の同一性でマッピングしました。サンプル中の各属の存在量 (GAi; ml あたりの細胞数) は次のように計算されました。

ここで、 e は SAG を生成しなかった属の正規化係数であり、次のように定義されます。

ここで、ai は属 i SAG にリクルートされたメタゲノムリードの数、bi はタンパク質をコードする属 i SAG アセンブリ内のヌクレオチドの平均割合、c はメタゲノム内のリードの総数、di は平均推定ゲノムサイズです。属 i SAG および f は原核プランクトンの総存在量 (1 ml あたりの細胞数) です。この計算はサンプリング日ごとに繰り返されました。

細胞あたりの転写産物の平均数 (TCi) は、各属および遺伝子について次のように計算されました。

ここで、 ai は目的の遺伝子にマッピングされたリード数、 b はサンプルに追加された MTST5 および MTST6 RNA 転写物の数、 c は MTST5 および MTST6 にマッピングされたリード数、したがって、比 b/c は読み取りあたりの転写産物、d はフィルター上で収集されたサンプルの体積 (ml)、GAii は属の存在量 (ml あたりの細胞数、上記参照) です。この計算はサンプリング日ごとに繰り返されました。

各 GoM 海水サンプル中の各属の平均細胞呼吸速度 (ACRi; 細胞あたり 1 時間あたりのアモル O2) は次のように推定されました。

ここで、R は次のように定義されます。

ここで、ai は、SAG で回収された特定の属の細胞の平均呼吸数であり、推定呼吸数が検出限界 (細胞あたり 1 時間あたり 4 amol O2) を超えています。bi は、属 i に属すると分類された SAG の数です (つまり、属 i) の活性細胞の数、c はすべての RSG SAG の数 (サンプル内の配列決定された活性細胞の数とも呼ばれます)、したがって bi/c は属 i の活性細胞の割合、d は合計検出限界を超える推定呼吸数を持つ活性細胞の濃度（mlあたりの細胞数、補足表2）、zは検出された最小細胞固有呼吸数（細胞あたり1時間あたりのamol O2）に等しい。

量 R は、ml あたりの属 i の活性細胞の数です。量 0.5 × z[GAi − R] は、検出限界を下回るセルの補正係数です。測定方法の感度が異なるため、R が GAi よりわずかに大きくなる場合がありました。これが起こったとき、R は GAi に等しく設定され、GAi − R = 0 となります。この計算はサンプリング日ごとに繰り返されました。この計算は、少なくとも 3 つの RSG 標識 SAG が同定された属およびサンプルに対してのみ行われました。

主要な栄養素濃度の測定では、単一細胞ゲノミクスおよび呼吸分析で使用したのと同じサンプルから GoM 海水の 100 ml のサブサンプルを収集しました。これらのサンプルをすぐにヌクレオポアトラックエッジ膜 25 mm、孔径 0.4 μm フィルター (Whatman) で濾過し、SEAL AA3 (Seal分析限定）。さらに、それぞれ 100 ml の 3 つの海水サブサンプルを各フィールドサンプルから収集し、ガラスマイクロファイバーフィルター (Whatman、GF/F) 上で 2 時間以内に真空濾過しました。各 GF/F フィルターを 90% アセトン 10 ml 中で -20 °C で 24 ～ 48 時間抽出しました。抽出物は、50 μl の 10% HCl の添加前後に 10-AU 蛍光光度計 (Turner Designs) で分析され、クロロフィルとフェオフィチンの濃度は前述のように測定されました 79

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

すべてのメタゲノムとメタトランスクリプトームのリード、および 100 kb を超える単一細胞ゲノムアセンブリは、NCBI BioProject PRJNA846736 の下で利用できます。 100 kb 未満の 603 ゲノムアセンブリを含むすべてのメタゲノムおよびメタトランスクリプトームのリードと単一細胞ゲノムアセンブリは、Open Science Framework (https://osf.io/r2un6) で入手できます。

すべての分析はオープンアクセスソフトウェアを使用して実行されました。リクエストに応じて、結果を結合して画像を生成するために使用されるカスタムスクリプトを利用できます。

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単一細胞ゲノムデータの生成については、ビゲロー海洋科学研究所の単一細胞ゲノミクスセンターの B. Thompson、C. Mascena、B. Tupper に感謝します。 MA Moran、C. Smith、B. Nowinski には定量的トランスクリプトミクスワークフローの確立にご協力いただきました。 MA Moran 氏と S. Giovannoni 氏、原稿についてコメントをいただきました。 R/V サルミエント・デ・ガンボア、R/V ラモン・マルガレフ、R/V アトランティスの船長と乗組員が海上で支援してくれました。 K. Ziervogel、K. Dykens、D. Moser、R/V Atlantis の AT42-11 でのサンプル収集にご協力いただきました。 C. González-Pola と JM Arrieta は、クルーズに参加する機会を提供してくれました。 RADPROF 2018 では、INOCEN 研究所 (IEO、PI M. Álvarez) が酸素分析を担当しました。R. Santiago と A. Massanet は、マヨルカ島サンプルの化学分析に協力してくれました。 GoM からの海水サンプルはイーストブースベイにあるビゲロー研究所の波止場から採取され、許可は必要ありませんでした。 AT42-11 からの海水サンプルは、カナダ政府の同意を得て収集されました。この研究は、米国国立科学財団 (RS、DE、BNO、NJP に 1826734、BNO に 1737017、RS に 1335810)、オーストリア科学基金 (FWF) プロジェクト ARTEMIS (GJH に P28781-B21) からの賞によって支援されました。シモンズ財団助成金 (RS 827839) による。

これらの著者は同等に貢献しました: Jacob H. Munson-McGee、Melody R. Lindsay

Bigelow 海洋科学研究所、イーストブースベイ、メイン州、米国

ジェイコブ・H・マンソン・マギー、メロディ・R・リンゼイ、ジュリア・M・ブラウン、ティモシー・ダンジェロ、ジョー・ブラウン、ローラ・C・ルベルチク、デヴィッド・エマーソン、ベス・N・オーカット、ニコール・J・ポールトン、ラムナス・ステパナスカス

ウィーン大学、機能進化生態学部、ウィーン、オーストリア

エヴァ・シンテス & ゲルハルト・J・ハーンドル

Instituto Español de Oceanografía-CSIC、セントロ海洋グラフィカデバレアレス、パルマ、スペイン

エヴァ・シンテス

パデュー大学、ウェストラファイエット、インディアナ州、米国

パクストン・トムコ

オランダ王立海洋研究所（NIOZ）、ユトレヒト大学、オランダ、デンブルク、海洋微生物学および生物地球化学部門

ゲルハルト・J・ヘルンドル

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RS、BNO、NJP、DE、GJH がこの研究を発案し、資金を確保しました。 MRL、TD、ESは培養を維持し、呼吸を測定した。 JHM-M.、MRL、ES、TD、LCL、NJP、および RS がサンプルを収集し、データを生成しました。 JHM-M.、MRL、JMB、TD、JB、PT がデータを分析しました。 JHM-M.、MRL、NJP、RS は、著者全員からの意見をもとにこの論文を執筆しました。

ラムナス・ステパナウスカスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature は、この研究の査読に貢献してくれた Damien Eveillard と他の匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

接種から定常期にわたる時間経過にわたって、水生微生物の培養分離株を含む密封ボトル内の酸素濃度を測定した。これらのインキュベーションのサブサンプルを RSG でプローブし、その後、細胞の蛍光と存在量をフローサイトメトリーで測定しました。検量線は、平均細胞蛍光強度を、各培養における細胞存在量に対して正規化された酸素消費量と比較することによって作成されました。

A. 培養分離株のインキュベーションにおける細胞間の RSG 蛍光の多様性。 B. 個々の細胞の光側散乱 (x 軸) と緑色蛍光 (y 軸) の散布図に RSG 陽性細胞のゲートを設定します。各培養物は、その培養物の死滅した対照サンプルに基づいて、個別にゲート制御されました。

AB。 RSG 標識原核プランクトンのフローサイトメトリーゲーティング。 GoM 海水サンプルは 2019 年 4 月 2 日に収集され、熱処理前 (A) または熱処理後 (B) に RSG で標識されました。両方のサンプルの最初の 100,000 イベントが表示されます (イベントの大部分はベースライン上にあります)。 C. RSG (青色、n = 2,572) または SYTO-9 (オレンジ、n = 1,632) でプローブされたすべてのメイン湾 SAG のゲノム構築の完全性。ボックスは、平均値、第 1 四分位数と第 3 四分位数、および最大 1.5 の四分位間範囲に及ぶひげを示します。 D. ブースベイ港 (北緯 43.84 度、西経 69.64 度) 付近のクロロフィル濃度。黒い縦線は、SAG 分析用のサンプルが収集された日を示します。 E. 呼吸数と個々の細胞内のウイルス DNA の存在との関係。各データポイントは、単一のフィールドサンプル内の属を表します。 F. 海洋原核プランクトンの RSG 培養期間の最適化。 2 つの複製サンプルにおける RSG 陽性細胞の存在量と蛍光強度が示されています。

A. 2019 年 4 月 2 日の SAG。B. 2019 年 7 月 9 日の SAG。どちらのツリーにも、培養分離株が系統参照として含まれており、赤いフォントの色で示されています。樹木は、古細菌が存在する場合はその枝に根を下ろし、古細菌が含まれない場合は中間点に根を下ろしました。

細胞は、単一細胞ゲノム配列決定によって決定された分類学的クラスによって色分けされています。

大きな点は、単一細胞ゲノミクス用に分類された細胞を表します。色で強調表示されているのは、サンプリング日間で呼吸数に顕著な差がある系統です。フローサイトメーターの構成が変更されたため、2017 年の 3 つのサンプルの呼吸数を推定できませんでした。

A. 2019 年 3 月 9 日に南大西洋 (南緯 32.35 度、西経 44.02 度) で採取されたサンプルの細胞。 B. 2018 年 8 月 22 日に大西洋北部 (北緯 43.00 度、西経 11.33 度) で採取されたサンプルの細胞。中間地点には木々が根を張っていた。ブートストラップ値 >0.75 は黒丸で示されます。

A. 2019 年 5 月 23 日に北東太平洋 (北緯 47.76 度、東経 127.76 度) で採取されたサンプルの細胞。 B. 2019 年 3 月 20 日に赤道大西洋 (北緯 3.10 度、西経 29.01 度) で採取されたサンプルの細胞。樹木は古細菌の枝が存在する場合はその枝に根を下ろし、古細菌の枝が存在しない場合はその中間点に根を下ろします。ブートストラップ値 >0.75 は黒丸で示されます。

A. 日中に収集された細胞の前方散乱光と RSG 蛍光。 B. 夜間に収集された細胞の前方散乱光と RSG 蛍光。ラベル「R1」は、昼間と比較して夜間に存在量が多かった中間の呼吸速度を持つ細胞の位置を示します。ラベル「R2」は、呼吸速度が高い細胞の位置を示します。 C. 日中 (黄色、n = 190) と夜間 (青、n = 190) の属固有の呼吸数。少なくとも 3 つの RSG 陽性細胞が配列決定された属が示されています。赤いフォントは、昼と夜の間の呼吸数に統計的に有意な差がある属を示します (両側マンホイットニー U 検定、時点ごとに最小 4 細胞、AAA076-P13 p 値 = 0.010、UBA10364 p 値 = 0.038) 。ボックスは、中央値、第 1 四分位数、および第 3 四分位数、および四分位範囲 (IQR) の最大 1.5 倍まで伸びるひげを示します。 1.5 IQR を上回るまたは下回る値は円で表されます。

A. 2021 年 8 月 24 日 14:00 に収集されたサンプルの細胞。B. 2021 年 8 月 25 日 02:00 に収集されたサンプルの細胞。ブートストラップ値 >0.75 は黒丸で示されます。樹木は、古細菌の枝が存在する場合はその枝に根を下ろし、古細菌の枝が存在しない場合は中間点に根を下ろします。

RSG 蛍光校正に使用される微生物分離株と培養条件 (補足表 1)。フィールドサンプルメタデータ (補足表 2)。個々の SAG の特性 (補足表 3)。 SAG属の特徴（補足表4）。 NFPPS-52-4K および RCP-30-5A ビーズキット (Spherotech、イリノイ州レイクフォレスト) の正規化された蛍光強度 (補足表 5)。

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転載と許可

Munson-McGee、JH、Lindsay、MR、Sintes、E. 他海洋原核プランクトンの呼吸数と存在量の切り離し。 Nature 612、764–770 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41586-022-05505-3

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受信日: 2022 年 2 月 14 日

受理日: 2022 年 11 月 1 日

公開日: 2022 年 12 月 7 日

発行日: 2022 年 12 月 22 日

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