ニタゾキサニドはアセチル化KLF5を阻害する

BMC Medicine volume 21、記事番号: 68 (2023) この記事を引用

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9 オルトメトリック

メトリクスの詳細

去勢抵抗性前立腺がんは骨に転移することが多く、そのような骨転移は最終的に利用可能な治療法に抵抗性を示し、患者の死につながります。骨に豊富に存在する TGF-β は、骨転移の発生において極めて重要な役割を果たします。しかし、TGF-β またはその受容体を直接標的とすることは、骨転移の治療にとって困難でした。我々は以前、TGF-βが転写因子KLF5のK369におけるアセチル化を誘導し、それに依存して、EMTの誘導、細胞浸潤、骨転移などの複数の生物学的プロセスを調節することを発見した。したがって、アセチル化 KLF5 (Ac-KLF5) とその下流エフェクターは、前立腺がんにおける TGF-β 誘発骨転移を治療するための潜在的な治療標的となります。

1987 年に FDA に承認された薬剤の浸潤抑制をスクリーニングするために、Ac-KLF5 を模倣する KLF5K369Q を発現する前立腺がん細胞にスフェロイド浸潤アッセイが適用されました。ルシフェラーゼおよび KLF5K369Q 発現細胞を、尾動脈を介してヌードマウスに注射し、骨転移をモデル化しました。生物発光イメージング、マイクロ CT)、および組織学的分析が、骨転移のモニタリングと評価に適用されました。ニタゾキサニド (NTZ) によって調節される遺伝子、シグナル伝達経路、および根底にあるメカニズムを理解するために、RNA シーケンス、生物情報学、および生化学分析が使用されました。 KLF5 タンパク質への NTZ の結合は、蛍光滴定、高速液体クロマトグラフィー (HPLC)、および円二色性 (CD) 分析を使用して評価されました。

駆虫薬である NTZ は、スクリーニングおよび検証アッセイにおいて強力な侵入阻害剤として同定されました。 KLF5K369Q 誘発性骨転移において、NTZ は予防および治療モードで強力な抑制効果を発揮しました。 NTZ はまた、KLF5K369Q によって誘導される骨転移の原因となる細胞プロセスである破骨細胞の分化も阻害しました。 NTZは、127遺伝子の上方制御および114遺伝子の下方制御におけるKLF5K369Qの機能を減弱させた。一部の遺伝子の発現変化は、前立腺がん患者の全生存期間の悪化と有意に関連していた。そのような変化の 1 つは、前立腺がんの骨転移を機能的に促進する MYBL2 の上方制御でした。さらなる分析により、NTZがKLF5タンパク質に結合し、KLF5K369QがMYBL2のプロモーターに結合してその転写を活性化し、NTZがKLF5K369QのMYBL2プロモーターへの結合を弱めることが実証された。

NTZ は、前立腺がんおよびおそらく他のがんにおける TGF-β/Ac-KLF5 シグナル伝達軸によって誘発される骨転移の潜在的な治療薬です。

査読レポート

前立腺がん (PCa) は、男性のがん関連死亡の主な原因の 1 つです [1]。 PCa の初期段階では、局所的な腫瘍は手術または放射線療法でうまく治療できますが、患者の約 20 ～ 30% が再発します [2]。再発患者は通常、最初はアンドロゲン除去療法に敏感ですが、最終的には去勢抵抗性前立腺がん（CRPC）を発症します[3]。ほとんどの CRPC は転移し、その約 90% は骨に転移します [4、5]。他の悪性腫瘍の骨転移と同様に、骨内の CRPC の転移は最初はタキサンなどの標的療法に反応します。それでも、事実上すべての人が治療抵抗性を発症し、不治の病になります。薬剤耐性骨転移の場合、デノスマブ、ゾレドロン酸、ビスホスホネートなどの利用可能な治療法は、症状や罹患率を軽減し、骨格関連イベント（SRE）を予防または遅延させることしかできません。このような治療は患者の全生存期間を大幅に改善するものではありません[6、7]。したがって、前立腺がんや、乳がん、肺がん、多発性骨髄腫などの骨転移を生じる他の種類の悪性腫瘍に対して、薬剤耐性骨転移に対する新規で効果的な治療法の開発が緊急に必要とされています。

骨環境には、さまざまな生理学的および病理学的プロセスを調節するサイトカインである TGF-β (トランスフォーミング成長因子-β) が豊富に含まれています。 TGF-βは、腫瘍形成の初期段階で細胞増殖と腫瘍増殖を抑制しますが、骨転移の進行において極めて重要な役割を果たしています[8、9、10、11]。 TGF-βシグナル伝達は骨転移を治療するための魅力的な標的であるが、TGF-βとその受容体を直接標的とすることは、さまざまな理由から困難であることが証明されている[12、13、14]。たとえば、TGF-β は組織の恒常性において重要な機能を持っています [14]、TGF-β を標的とする化合物は多くの場合選択的ではないため、心臓組織や皮膚に毒性を引き起こす可能性があります [15、16]。

我々の以前の研究は、上皮細胞において、TGF-βが転写因子KLF5（クルッペル様因子5）のリジン369（K369）におけるアセチル化を誘導することを実証した[17、18]。その後、TGF-β とアセチル化 KLF5 (Ac-KLF5) は、遺伝子転写と、細胞増殖、細胞の運動性と浸潤、上皮間葉転換 (EMT) などのさまざまな細胞プロセスを制御するシグナル伝達軸を形成します [17、18、19、 20,21]。より最近では、TGF-β/Ac-KLF5 軸も前立腺がんの骨転移と薬剤耐性を誘発することを発見しました [22、23]。重要なことは、TGF-βが豊富な骨環境からの前立腺がん転移は、内臓組織からの転移よりも実際に高レベルのAc-KLF5を発現していることである[23]。 TGF-βとAc-KLF5が軸を形成し、TGF-βが骨転移を誘導するにはAc-KLF5が必須であるという事実は、Ac-KLF5とその下流エフェクターがTGF-β誘発性疾患の治療の代替治療標的であることを示唆している。 PCaの骨転移。

この研究では、Ac-KLF5を模倣する変異体であるKLF5K369Qを発現する前立腺癌細胞に対するin vitroスフェロイド浸潤スクリーニングアッセイを採用した[22、23]。このシステムを使用して、1987 年に FDA に承認された薬剤をスクリーニングし、細胞浸潤と骨転移を阻害する薬剤を特定しました。ここでは、スクリーニング結果について説明し、マウスモデルにおける駆虫薬ニタゾキサニド（NTZ）が骨転移の強力な阻害剤であるというデータを提示します。また、NTZ の骨転移抑制効果を裏付ける細胞データと分子データを提示し、NTZ がどのように骨転移を抑制するかについてのメカニズムを提供します。

FDA 承認の薬物ライブラリーミニ (カタログ番号: HY-L022M) は、96 ウェルプレートに 1987 種類の薬物が含まれ、10 μL のジメチルスルホキシド (DMSO) に 10 mM で溶解されており、MedChemExpress (上海、中国) から購入しました。追加のニタゾキサニド (カタログ番号: HY-B0217) を MedChemExpress から購入し、100 mM 濃度で DMSO に溶解しました。

我々は以前に、野生型KLF5、Ac-KLF5模倣変異体KLF5K369Q（KQ）、アセチル化欠損変異体KLF5K369R（KR）、およびpLHCXベクターコントロールを発現する安定したPC-3およびDU 145ヒトPCa細胞株を確立しました。 [22]。 PC-3-KLF5、PC-3-KQ、PC-3-KR、PC-3-pLHCX など、さまざまな形式の KLF5 を発現する PC-3 細胞を、10% ウシ胎児血清を添加した RPMI-1640 培地で維持しました。 (FBS、Biological Industries、HAMEK、イスラエル) および 1% ペニシリン/ストレプトマイシン (100 U/mL、Biological Industries)。異なる形態のKLF5を発現するDU 145細胞を、10％FBSを含む最小イーグル培地（MEM）（Corning、ニューヨーク、米国）中で培養した。

PC-3-KLF5、PC-3-KQ、および PC-3-KR 細胞を、ルシフェラーゼを発現するレンチウイルス (HBLV-LUC-PURO、Hanbio、上海、中国) に感染させました。感染細胞はピューロマイシン (2 μg/mL) を含む培地中で安定な細胞集団として選択されました。

RAW264.7 マクロファージ細胞株は、American Type Cell Culture (ATCC、米国バージニア州マナサス) から入手し、10% FBS を補充したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) (Biological Industries) で培養しました。すべての細胞は、5% CO2 を含む加湿雰囲気下、37℃で培養されました。

さまざまな形態の KLF5 を発現する PC-3 細胞を無血清培地に懸濁し、トランスウェルデバイス (カタログ番号: 353097、Corning) の上部チャンバーにウェルあたり 5 × 104 細胞で播種しました。 15% FBSを含む750μLの完全培地を下部チャンバーに添加した。 48 時間後、膜の上側の細胞をコットンスワップを使用してこすり落とし、下側の細胞を紫色の結晶 (カタログ番号: C0121、Beyotime Biotechnology、上海、中国) で染色し、ステレオスコープを使用して写真撮影しました。（Mshot、広州、中国）。次いで、膜を下部チャンバー内の５００μＬの３３％酢酸中に入れて、細胞を溶解した。溶解細胞の光学密度は、マイクロプレートリーダー (BioTek、Winooski、バーモント州、米国) を使用して 570 nm で測定しました。

浸潤アッセイは以前に記載されているように実施されました[24]。簡単に説明すると、80～90％コンフルエントのPC-3-KQ細胞を、超低付着性の384ウェル丸底プレート（カタログ番号：4516、Corning）上に、80μL培地中1ウェルあたり500細胞でプレーティングした。次いで、プレートを３２０ｇで４分間遠心分離して、ウェルの底に細胞をクラスター化し、３日間インキュベートした。 4日目に、40μLの培地を各ウェルから除去し、40μLのマトリゲル-培地混合物を各ウェルに添加し、細胞をさらに3日間培養した。マトリゲル (カタログ番号: 354234、Corning) は Corning 製で、培地には 1% FBS が含まれていました。インキュベーションの最後に、10倍の対物レンズを備えた位相差顕微鏡（Eclipse Ti2、Nikon、東京、日本）を使用して画像を撮影し、細胞の総面積と細胞のコア球面積（図1a）を測定しました。 Image J ソフトウェアを使用して測定。浸潤面積は、次の式を使用して計算されました:浸潤面積 = 細胞の総面積 – コア球面積 [25]。

アセチル化 KLF5 によって誘導される細胞浸潤を阻害する FDA 承認薬のスクリーニング。スクリーニングのワークフローの概略図。 b 3D スフェロイド浸潤アッセイを使用して分析した、PC-3-KQ 細胞の浸潤に対する 1987 年の FDA 承認薬とビヒクル対照 (緑色の矢印で示された緑色の点) の阻害効果。各ドットは薬物または対照を表し、ドットは X 軸に沿って整列します。 Y 軸は、各薬物の 2 つのウェル間の平均浸潤面積を示します。青い水平線はすべての薬剤とコントロールの平均浸潤面積を示し、赤い水平線は平均浸潤面積の 50% を示します。 c 1987 年に非腫瘍薬 (紫色)、腫瘍標的治療薬 (オレンジ色)、および腫瘍化学療法薬 (赤色) として承認された薬剤の割合。 d 複数の濃度（μM）での 3D スフェロイド浸潤アッセイを使用した、最も効果的な 25 種類の薬剤の同定。ヒートマップは、さまざまな強度の青いグリッドで示されるように、ビヒクルコントロールと比較したときの各薬物の複数の濃度の浸潤率 (%) を示します。 25 種類の薬剤の名前が下部に表示され、最も効果的な 6 種類が赤いボックスでマークされています。 e ニタゾキサニドの化学構造

薬物スクリーニングでは、4日目に培地を交換するときに薬物をマトリゲル培地混合物に添加した。スクリーニングの最初のラウンドでは、すべての薬物に対して最終濃度10μMを使用した。 2 回目のスクリーニングでは、0、0.001、0.01、0.1、1、10 μM などの複数の薬物濃度を使用しました。各濃度について 2 つのウェルを繰り返しました。

メーカーの説明書に従って、Beyotime Biotechnology のキットを使用して細胞生存率を測定しました。簡単に説明すると、細胞を 96 ウェルプレートにウェルあたり 5 × 103 細胞で播種し、一晩インキュベートした後、0、0.02、0.05、0.14、0.41、1.23、3.7、11.1、33.3、および 100 の薬物で 48 時間処理しました。 μM。フラギン、ニフラテル、ニタゾキサニド、レタパムリンの 4 つの薬物が分析されました。薬物処理の終了時に培地を除去し、CCK-8 溶液を各ウェルに 100 μL/ウェルで添加し、37℃で 1.5 時間インキュベートし、光学密度 (OD) をを使用して 450 nm で測定しました。マイクロプレートリーダー（BioTek）。

また、96 ウェルプレートの各ウェルに 2 × 103 細胞および 2.5 × 103 細胞を播種することにより、CCK-8 アッセイを使用して、PC-3-KQ および DU 145-KQ 細胞のより広範囲の NTZ 濃度をテストしました。 PC-3-KQ 細胞は 0、0.01、0.1、1、25、2.5、および 5 μM の NTZ で処理しましたが、DU 145-KQ 細胞は 0、0.01、0.1、5、10、および 20 μM の NTZ で処理しました。 0、24、48、および72時間のμM。生存細胞の数は、上記のように CCK-8 溶液を使用して決定されました。

PC-3-KQ 細胞と DU 145-KQ 細胞を 1 × 103 細胞/ウェルで 6 ウェルプレートに播種しました。 24 時間のインキュベーション後、PC-3-KQ 細胞を 0、1.25、2.5、および 5 μM の NTZ で処理し、DU 145-KQ 細胞を 0、5、10、および 20 μM の NTZ で 8 日間処理しました。。薬剤を含む培地は2日ごとに交換した。 8日目に、細胞を冷PBSですすぎ、4%パラホルムアルデヒドで10分間固定し、紫色結晶で10分間染色し、写真を撮り、Image Jソフトウェアを使用して画像を分析した。

生後 3 ～ 4 週の雄の Balb/c ヌードマウスを Charles River (北京、中国) から購入しました。南方科学技術大学 (SUSTech) の動物センターに到着したマウスは、使用前に 1 週間隔離されました。すべてのマウスは、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って維持および取り扱いされました。

NTZがAc-KLF5誘発性の骨転移を阻害するかどうかを測定するために、予防モードと治療モードの両方を使用しました。予防モデルとしては、最近発表された方法 [26] に従い、マウスを麻酔し、尾動脈をアルコールで拭いて血管を拡張し、1×106 細胞の癌細胞 (PC-3-KQ-Luc または PC-3) を使用しました。 -KR-Luc 細胞）を含む 100 μL PBS を尾動脈に短時間（< 3 秒）で注入しました [26]。次に、マウスをビヒクル群とNTZ群(各群6匹のマウス)にランダムに分け、0日目に治療を受けました。腫瘍の成長と体重を毎週測定しました。 5週間の治療後、すべてのマウスを屠殺し、ヘマトキシリン・エオシン(H&E)染色のために骨組織および主要臓器を切除した。調査期間の 5 週間の選択は、注射後 5 週間で明らかな骨転移が形成されたが、脳、肝臓、肺、脾臓、心臓、前立腺、精嚢を含む他の臓器には腫瘍が検出されなかったパイロット実験に基づいています。、小腸、および精巣（データは示されていない）。

治療モデルでは、100μL PBS中の1×106個のPC-3-KQ-Luc細胞を上記のように各マウスの尾動脈に注射した。 7日ごとに、マウスを生物発光（BL）イメージングで行い、溶媒群とNTZ群（各群n = 6）にランダムに分け、7日目に治療を受けました。腫瘍の成長と体重を毎週測定しました。最終治療から 35 日後に、高解像度マイクロコンピュータ断層撮影 (マイクロ CT)、H&E 染色、および免疫組織化学的染色のために各グループの骨組織が剥ぎ取られました。

骨内の腫瘍増殖は、Living Image Software 4.4 (IVIS Spectrum、PerkinElmer Health Sciences、マサチューセッツ州、米国) を使用した in vivo BL イメージングによって週に 1 回測定しました。 D-ルシフェリンナトリウム塩（15 mg/mL、10 μL/g BW）（GM-040611、Genomeditech、上海、中国）の腹腔内注射の 10 分後、以下の条件で生物発光画像を取得しました: オープンエミッションフィルター、露光時間= 60 秒、ビニング = 中: 8、視野 = 12.9 × 12.9 cm、および f/ストップ = 1。その後、Living Image 4.4 ソフトウェア (PerkinElmer) を使用して画像を分析しました。治療の最後に、関心領域（ROI）の光子束によって生物発光強度を測定し、ビヒクル治療グループとNTZ治療グループの間で比較しました。

薬物処理には、1% カルボキシメチルセルロースナトリウム (CMC) (カタログ番号: CC0113、Leagene Biotechnology、北京、中国) をビヒクル対照として使用し、NTZ を CMC に溶解しました。 NTZ を毎日、胃内投与 (100 mg/kg BW) によってマウスに送達しました。

マウスを屠殺した後、後肢を切除し、4% パラホルムアルデヒド中で 48 時間固定しました。次に、マイクロ CT スキャナー (Skyscan1276、Bruker、Kontich、ベルギー) を使用して四肢をスキャンしました。マイクロ CT イメージングの場合、スキャンパラメーターは次のとおりです。電源電圧、60 kV。ソース電流、100μA。 AI 0.5 mm フィルター; ピクセルサイズ、10μm。回転ステップ、0.4 度。次に、NRecon ソフトウェア (バージョン 1.7.1.6、Bruker) を使用して画像を処理および構築し、Dataviewer (バージョン 1.5.4、Bruker) を使用して変換しました。大腿骨成長プレートから 0.5 mm の位置に設定された関心領域 (ROI) は、CT アナライザー (CTAn) プログラムを使用して分析されました。パラメータには、骨体積/総体積 (BV/TV)、骨梁数 (Tb.N)、骨梁分離 (Tb.Sp)、および骨梁の厚さ (Tb.Th) が含まれます。最後に、3D 画像は CTvox ソフトウェア (バージョン 2.0、Bruker) で実行されました。

大腿骨は、エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 脱灰溶液 (カタログ番号: R20403-5L、OKA、北京、中国) で 14 ～ 21 日間脱灰されました。脱灰後、骨組織を 70% から 95% の勾配エタノールで脱水し、n-ブタノールに 6 時間浸漬し、その後パラフィンに包埋しました。組織ブロックを 4 μm の切片に切断しました。オーブンで 63°C で 1.5 時間ベーキングした後、組織スライドをキシレンで脱パラフィンし、勾配エタノールで水和し、H&E (カタログ番号: BA4025、BaSO、珠海、中国) で染色しました。次に、分析用に中性樹脂 (カタログ番号: 25608-33-7、Sigma-Aldrich、MO、USA) を使用してスライドをマウントしました。

免疫組織化学的染色は確立された手順に従って実施されました。簡単に説明すると、骨組織の 4 μm 切片をキシレン中で脱パラフィンし、勾配エタノール中で再水和しました。内因性抗原は、スライドを 10 mM クエン酸ナトリウム緩衝液 (カタログ番号: C1010、Solarbio、北京、中国) 中で 65°C のオーブンで一晩インキュベートすることによって回収されました。抗原賦活化後、組織切片を 3% 過酸化水素とともに室温で 10 分間インキュベートして、内因性カタラーゼ活性をブロックしました。次に、それらをブロッキング溶液（10％ヤギ血清と混合した0.1％アルブミンウシV）および一次抗体（MMP9、1：1000、カタログ番号：ab76003、Abcam、ケンブリッジ、英国; MYBL2、1:100、カタログ番号: ab76009、アブカム) 1.5 時間。 PBSで3回洗浄した後、スライドを二次抗体溶液で15分間インキュベートし、次にMaxVision II HRPキット(カタログ番号: KIT-5920、MXB Biotechnologies、福州、中国)を使用してDAB溶液でインキュベートしました。核をヘマトキシリンで2分間対比染色した。次に、スライドをエタノール (75 ～ 100%) とキシレンの勾配で脱水し、急速硬化封入剤を使用してカバースリップで封入しました。すべてのスライドは、Aperio VERSA 8 スキャナーシステム (Leica、Wetzlar、ドイツ) を使用してスキャンし、Image J ソフトウェア (Image J 1.48v、NIH、Bethesda、MD、USA) を使用して分析しました。

3 つの異なる培養系を in vitro 破骨細胞分化アッセイに使用しました。最初の方法では、RAW264.7 細胞を 1 × 103 細胞/ウェルで 96 ウェルプレートに播種し、一晩培養しました。次に細胞を、さまざまな濃度のNTZ（0、6.25、12.5、25μM）の存在下または非存在下で、50 ng/mLの組換えマウスRANKL（カタログ番号：CR06、Novoprotein、上海、中国）で刺激しました。対照群で破骨細胞が観察されるまで、培地を２日ごとに交換した。次に細胞を 4% パラホルムアルデヒドで 10 分間固定し、予熱した脱イオン水ですすぎ、Sigma-Aldrich のキット (カタログ番号: A387) を使用して酒石酸耐性酸性ホスファターゼ (TRAP) で染色して、破骨細胞 (核 3 個以上) を視覚化しました。細胞）。破骨細胞の分化に対するＮＴＺの効果は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＩｍａｇｅＪ１．４８ｖ）を使用して多核細胞の数を計数することによって決定した。

2 番目の in vitro アッセイでは、NTZ 処理した Ac-KLF5 発現細胞からの馴化培地 (CM) を使用しました。 PC-3-KQ 細胞を 6 ウェルプレートにウェルあたり 1 × 105 細胞で播種し、一晩培養しました。細胞を、完全培地(10% FBSおよび1% ペニシリン-ストレプトマイシンを含むRPMI1640)中で0、1.25、2.5、および5μMのNTZで36時間処理した。培地を除去し、細胞を0.5% FBSを含むRPMI1640培地で2回洗浄し、同じ培地でさらに12時間培養した。続いて、馴化培地（CM）を各グループから収集し、遠心分離し、濾過し、等分して、さらなる使用のために、または共培養実験ですぐに使用するために-80℃で保存しました。各グループの CM を DMEM 培地 (10 % FBS) と 1:3 の比率で混合し、RANKL をより低い濃度 (10 ng/mL) で添加しました。 24時間培養した96ウェルプレート中のRAW264.7細胞をCM含有培地で7日間インキュベートし、培地を2日ごとに交換した。メーカーの指示に従って、分化した破骨細胞の数を決定するためにTRAP染色アッセイを実施した。

3 番目の in vitro アッセイでは、RAW264.7 細胞と癌細胞の直接共培養が行われました。 RAW264.7細胞を96ウェルプレートにウェルあたり700細胞で播種し、12時間接着させました。 PC-3-KQ細胞を各ウェルに300細胞/ウェルで添加し、培養を12時間継続した。 NTZを添加して、様々な最終濃度(0、1.25、2.5、5μM)で48時間細胞を処理した。 RAW264.7培地とPC-3培地を7:3で混合し、2日ごとに培地を交換した。 7日後、破骨細胞の分化を上記のように測定した。

組織における TRAP 染色の手順は、以前の研究で説明されています [23]。簡単に説明すると、脱パラフィンおよび水和した骨切片を 0.2 M 酢酸中で 20 分間インキュベートし、次にファストレッド TR 塩 (1.1 mg/mL) およびナフトール AS-MX リン酸塩 (0.5 mg/mL) を含む 0.2 M 酢酸中で約 3 分間インキュベートしました。 37℃で45分。顕微鏡を使用して観察して、TRAP 陽性細胞が赤くなったら、スライドをヘマトキシリンで対比染色し、グリセリンを使用してカバースリップでマウントしました。次いで、スライドを上記のようにスキャンして分析した。

PC-3-KQ および PC-3-KR 細胞を 1 × 105 細胞/ウェルで 6 ウェルプレートに播種し、24 時間培養しました。次に、培地を 0 または 5 μM NTZ を含む培地に交換し、48 時間処理しました。次に、細胞を予冷した PBS で 1 回リンスし、TRIzol 試薬 (カタログ番号: 15596018、Invitrogen、米国カリフォルニア州カールズバッド) に収集しました。 RNA の抽出、SE100 プロトコルを使用したライブラリーの構築、およびペアエンド 100 bp 配列長の DNBSEQ プラットフォームによる配列決定は、北京ゲノミクス研究所 (中国、武漢) によって実行されました。生データの処理は前述のように完了しました [14]。すべての RNA-seq データは品質評価のために FASTQC によって処理され、Bowtie2 (V2.2.5) [27] を使用してヒトゲノムと位置合わせされました。

|edgeR アルゴリズムを実行して、KLF5K369Q 発現細胞と KLF5K369R 発現細胞、および KLF5K369Q 発現細胞における NTZ 処理およびコントロール間で差次的に発現される遺伝子を |倍数変化| で同定しました。 ≥ 1.5、誤検出率 < 0.05。私たちの配列データは、アクセッション番号 GSE216126 で Gene Expression Omnibus データベースに寄託されています。

発現がKLF5K369Qによって特異的に調節され、そのような調節がNTZによって減弱された遺伝子については、ヒト前立腺がんにおける遺伝子発現の変化が患者の生存に関連するかどうかを評価するために、カプラン・マイヤー生存分析が実行されました。私たちは、Survival R パッケージを使用して、Stand Up To Cancer/Prostate Cancer Foundation (SU2C/PCF) East Coast Dream Team (ECDT) (https://www.cbioportal.org/) からのデータを分析しました。各データセットの遺伝子発現レベルの中央値に基づいて、患者を 2 つのグループに層別しました。ログランク検定を使用して p 値を計算しました。単変量ハザード比も計算されました。

SU2C/PCF データセット [28] および GSE21034 データセット [29] を使用して、生存に有意に関連する遺伝子の発現レベルが正常前立腺組織、前立腺癌、および骨転移の間で比較されました。ウィルコクソン順位和検定を使用して 2 つのグループ間の比較の p 値を決定し、クラスカル-ウォリス検定を複数グループの比較に使用しました。両側統計検定を実行し、p 値 < 0.05 を統計的に有意であるとみなしました。すべての分析は R4.1.3 (https://www.R-project.org/) で実行されました。

Eastep Super total RNA 抽出キット (カタログ番号: LS1040、Promega、上海、中国) を使用して細胞から全 RNA を抽出し、NanoDrop One (Thermo Fisher Scientific、米国マディソン) を使用して定量しました。 HiScript III オールインワン RT SuperMix キット (カタログ番号: R333-01、Vazyme、南京、中国) を使用して、1 μg の全 RNA から一本鎖 cDNA を合成しました。 qRT-PCR では、cDNA テンプレートを酵素を含まない水中で SYBR Green 試薬と混合し、Qtower3 タッチシステム (Analytik Jena、イエナ、ドイツ) を次のプログラムで PCR に使用しました。 5 分間、95 °C で 30 秒、60 °C で 30 秒、72 °C で 30 秒を 40 サイクル、最終融解は 15 秒。 GAPDHを内部対照として使用した。プライマー配列は次のとおりでした: 5'-CTTGAGCGAGTCCAAAGACTG-3' (MYBL2 フォワード)、5'-AGTTGGTCAGAAGACTTTCCCT-3' (MYBL2 リバース)、5'-CAGCATTTCATCGAGGTAGAGAC-3' (TIMM8A フォワード)、5'-AGCCCGACTGTCCAACTTTG-3' ( TIMM8A リバース)、5'-TGAAGGTGACAGAGCCTCTGGAT-3' (E-カドヘリンフォワード)、5'-TGGGTGAATTCGGGCTTGTT-3' (E-カドヘリンリバース)、5'-TGAAGGTGACAGAGCCTCTGGAT-3' (ビメンチンフォワード)、5'-CTTGTAGGAGTGTCGGTTGTTAAG-3 ' (ビメンチンリバース)、5'-GACAATGCCCCTCAAGTGTT-3' (N-カドヘリンフォワード)、5'-CCATTAAGCCGAGTGATGGT-3' (N-カドヘリンリバース)、5'-CTTCCAGCAGCCCTACGAC-3' (Snail フォワード)、5'-CGGTGGGGTTGAGGATCT -3 ' (カタツムリリバース)、5 '-TGTTTGCAAGATCTGCGGC-3 ' (ナメクジフォワード)、5 '-TGCAGTCAGGGCAAGAAAAA-3 ' (ナメクジリバース)、5 '-CCATAAAGGGCAACCAAGAG-3 ' (フィブロネクチンフォワード)、5 '-ACCTCGGTGTTGTAAGGTGG-3 ' (フィブロネクチンリバース)、5'-TGCAGTCAGGGCAAGAAAAA-3' (ナメクジリバース)、5'-TGTACCGCTATGGTTACACTCG -3' (MMP9 フォワード)、5'-GGCAGGACAGTTGCTTCT-3' (MMP9 リバース)、5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3' ( GAPDH フォワード）、および 5'-GTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'（GAPDH リバース）。

6 ウェルプレート内の細胞を冷 PBS で洗浄し、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤 (カタログ番号: P1045、Beyotime) を含む溶解バッファーに収集してタンパク質を抽出しました。冷蔵遠心分離機で4℃で10分間遠心分離した後、上清を収集し、4×ローディングバッファーと混合し、金属熱浴中で100℃で10分間煮沸し、その後10% SDS-PAGEに供しました。。タンパク質を活性化PVDF膜(孔径0.45μm、カタログ番号:IPVH00010、Millipore、Carrigtwohill、アイルランド)上に転写した。メンブレンを 5% スキムミルクで室温で 40 分間ブロックし、一次抗体と 4°C で一晩インキュベートし、PBS で 3 回 (各 10 分間) 洗浄し、ウサギ IgG に対する HRP 結合二次抗体とインキュベートしました。 (1:5000、カタログ番号:7074S、Cell Signaling Technology、Danvers、MA、米国) 室温で 1 時間。シグナルは、自動化学発光分析装置 (ChampChemi 610 plus、北京、中国) で ECL 基質試薬 (カタログ番号: K-12043-D20、Advansta、カリフォルニア、米国) を使用して視覚化されました。 GAPDH 抗体は Cell Signaling Technology (1:2000、カタログ番号: 5174S) から購入しました。KLF5 抗体は Proteintech (1:1000、カタログ番号: 21017-1-AP、シカゴ、米国) から購入しました。MYBL2 抗体はAbcam (1:2000、カタログ番号: ab76009、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国) から入手し、MMP9 抗体は Abcam (1:2000、カタログ番号: ab 76003) から入手しました。

KLF5 およびネガティブコントロールの低分子干渉 RNA (siRNA) は、Ribobio (広州、中国) によって合成され、メーカーの指示に従って、リポフェクタミン RNAiMax 試薬 (カタログ番号: 13778150、Invitrogen) を使用して 50 nM で細胞をトランスフェクトするために使用されました。 48 時間後、ウェスタンブロッティングによるノックダウン効率テストを含む分析のために細胞を収集しました。 KLF5 siRNA の配列は 5'-AAGCUCACCUGAGGACUCA-3' でした [30]。

ChIP アッセイは、SimpleChIP Enzymatic Chromatin IP キット (カタログ番号: 9003s、Cell Signaling Technology) を製造元の指示に従って使用して実行しました。簡単に説明すると、細胞を架橋のために1%ホルムアルデヒドで10分間処理し、室温で5分間グリシンでクエンチし、収集し、37℃で20分間マイクロコッカスヌクレアーゼで消化した。 EDTA を加えて反応を停止させた後、超音波処理により DNA を断片化し、抽出物を KLF5 抗体 (カタログ番号: 21017-1-AP、Proteintech) または IgG (カタログ番号: 2729P、Cell Signaling Technology) とインキュベートしました。溶出された DNA 断片は、以下のプライマーを使用した通常の PCR および定量的リアルタイム PCR によって検出されました: 5'-CCTTCCTCGGTCTTCGCTAT-3' (MYBL2 #1 フォワード)、5'-GCACTTTTCTATCTCCCGCCA-3' (MYBL2#1 リバース)、5'- CCTGGAGATACTGGTGTGCAT-3' (MYBL2 #2 順方向)、および 5'-GGCCAAAAGAAACGGCCTCT-3' (MYBL2 #2 逆方向)。

野生型 KLF5、KLF5K369Q および KLF5K369R 変異体を pET15b 発現ベクター (カタログ番号: ZK146、Zoman Biotechnology、北京、中国) にクローニングし、発現時に KLF5 タンパク質の N 末端にヒスチジンタグを付加しました。プラスミドは大腸菌の BL21 DE3 株 (カタログ番号: EC1003、Weidi Biotechnology、上海、中国) で発現されました。細菌を遠心分離によって収集し、10 mM イミダゾールを含む PBS (10 mM、pH 7.4) 中で超音波処理し、His60 Ni Superflow 樹脂 (カタログ番号: L00666、GenScript、南京、中国) とともにインキュベートしました。 His-KLF5樹脂複合体を洗浄し、PBS(10mM、pH7.4)中の300mMイミダゾールで溶出した。ＫＬＦ５タンパク質は、結合アッセイで使用するために、ＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）を使用するＳｕｐｅｒｄｅｘ２００Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００カラム（カタログ番号：１０２４３５１９、ＧＥ、ＭＡ、ＵＳＡ）でのゲル濾過によってさらに精製した。

2 mL PBS 中の 1 μM の野生型または変異型 KLF5 タンパク質を、蛍光分光計 (HORIBA、京都、日本) を使用して蛍光スペクトルについて測定し、300 ～ 500 nm の波長で蛍光スペクトルを得ました。分析では、0.1 ～ 1 μM (0.1 μM 刻み)、1 ～ 5 μM (0.5 μM 刻み)、5 ～ 10 μM (1 μM 刻み)、および 10 –30 μM (5 μM 刻み)。 NTZとのインキュベーションは室温で5秒間行われました。 Origin ソフトウェア (OriginLab、米国マサチューセッツ州ノーサンプトン) を使用してデータを処理およびフィッティングし、結合親和性を取得し、Kd 値を 290 nm の波長での応答によって決定しました。

0.5 mL 中の 0.5 mg/mL の精製 KLF5 タンパク質またはその変異体を、His60 Ni Superflow 樹脂とともに室温で 30 分間インキュベートしました。 2回洗浄した後、タンパク質-ビーズ複合体をPBSで1 mLに希釈しました。タンパク質を含まない His60 Ni Superflow 樹脂をネガティブコントロール (つまりブランク) として使用しました。 10マイクロリットルの1mM NTZをタンパク質ビーズ複合体に添加し、室温で1時間インキュベートした。反応物を PBS で洗浄し、アセトニトリルとインキュベートしてタンパク質を変性し、捕捉された NTZ を放出しました。次に、Agilent 1260 Infinity II 装置 (米国カリフォルニア州) および C18 カラム (25 cm × 4.6 mm、5 μm) を使用し、流速 0.5 mL/min で 20 分間、HPLC 分析によって上清中の NTZ を検出しました。波長298nm。

2 mL PBS 中の 0.01 mg/mL の野生型または変異型 KLF5 タンパク質を、CD 分光偏光計 (Chirascan、Applied Photophysics、サリー、英国) を使用して 200 ～ 260 nm で分析しました。スペクトルは光路長 1 cm のキュベットで記録されました。平均 3 回の反復スキャンが各スペクトルに対して実行されました。 NTZを最終濃度1μMでタンパク質溶液に添加し、CD検出前に4℃で2時間インキュベートした。

定量的データは平均値 ± SD として示され、すべての実験は少なくとも 3 回繰り返されました。スチューデントの t 検定または一元配置分散分析を統計分析に使用しました。すべての統計分析は、GraphPad Prism 6 ソフトウェア [31] を使用して実行されました。 p 値 < 0.05 は統計的に有意であるとみなされます。

一般的に使用される前立腺がん細胞株（LNCaP、C4-2B、PC-3、およびDU 145）の中で、PC-3細胞が最も高いレベルのKLF5を発現することを確認しました（追加ファイル1：図S1a）。したがって、我々は、薬物スクリーニングおよび転移モデリングのために、野生型KLF5、Ac-KLF5模倣KLF5K369Q変異体、およびアセチル化欠損KLF5K369R変異体を発現する、以前に確立されたKLF5ヌルPC-3細胞株[23]を選択した。これらの細胞株におけるKLF5の発現レベルを図S1bに示します。また、KLF5K369Q発現細胞は、KLF5およびKLF5K369R発現細胞よりも、トランスウェルアッセイにおいてより遊走性があり（追加ファイル1：図S1c、S1d）、浸潤性が高いこと（追加ファイル1：図S1e、S1f）も検証しました。予想通り、KLF5K369Q発現細胞は、ビメンチン、N-カドヘリン、カタツムリ、ナメクジ、フィブロネクチンなどの間葉マーカーも高レベルで発現しました（追加ファイル1：図S1g、S1h）。

3D スフェロイド浸潤アッセイは、1987 年に FDA に承認された薬剤の細胞浸潤阻害能力をテストするために使用されました (図 1a)。 10 μM では、1987 年の薬剤のうち 87 種類が細胞浸潤を少なくとも 50% 阻害しました。これには、9 種類の化学療法剤、32 種類の癌標的治療薬、および 46 種類の非腫瘍薬が含まれます（図 1b、c; 追加ファイル 2: 表 S1）。

87 種類の薬剤について、0、0.001、0.01、0.1、1、および 10 μM を含む各薬剤の一連の濃度を使用して浸潤スクリーニングを繰り返しました。細胞浸潤に対するこれらの薬剤の影響を表 S1 に示します。用量依存的な浸潤阻害を示した 87 薬剤のうち上位 25 薬剤について、複数の薬剤濃度での浸潤アッセイを繰り返し、それらの浸潤阻害能力を再度確認しました (追加ファイル 2: 表 S2)。これら 25 種類の薬剤を、浸潤阻害能力の順に表 1 に示します。

これら 25 種類の薬剤について、PubMed データベースで薬剤名と「がん」、「転移」、または「骨転移」を含む出版物を検索し、これらの薬剤ががんや転移に関与しているかどうかを評価しました。 25 種類の薬剤のうち、11 種類は文献で癌または転移との関連性が十分に示されていましたが、14 種類は癌関連の出版物が限られているか、まったくありませんでした (表 1)。

25 種類の薬剤のうち、ニフラテル、マイトマイシン C、ニタゾキサニド、ロニダゾール、レタパムリン、フラギンを含む 6 種類の薬剤が 0.1 μM で細胞浸潤を 50% 以上阻害しました (図 1d、表 1)。 6種類の薬剤のうち、マイトマイシンCとロニダゾールはさらなる研究の対象から除外された。前者はがんおよびがん転移の治療に広く使用されている一方、後者は獣医学で使用される抗原虫薬だがヒトへの使用は承認されていないためである。残りの 4 つの薬剤について、CCK-8 アッセイを使用して、KLF5、KLF5K369Q、および KLF5K369Q を発現する PC-3 および DU 145 前立腺がん細胞における殺傷特異性と IC50 値を決定しました。 4 つの薬物のうちニタゾキサニド (NTZ) のみが、KLF5K369Q 発現細胞に対して、KLF5 および KLF5K369R 発現細胞よりも比較的小さい IC50 を示しました (表 2)。 NTZはまた、KLF5発現細胞よりもKLF5K369Q発現細胞における浸潤阻害においてより強力であった（追加ファイル1：図S2a、S2b）。したがって、追加の分析のために NTZ が選択されました。

CCK-8 アッセイを使用して、PC-3-KQ および DU 145-KQ 細胞に対する広範囲の NTZ 濃度の影響をテストしました。図１、２に示すように。 S3a および S3b、NTZ は、低濃度 (0 ～ 0.1 μM) では細胞数に影響を与えませんでしたが、高濃度では細胞数を減少させました。コロニー形成アッセイでは、NTZ は濃度が高くなるにつれてコロニー数を減少させました (追加ファイル 1: 図 S3c ～ S3f)。

予防モードと治療モードの両方を使用して、NTZ が Ac-KLF5 誘発性の骨転移を阻害するかどうかを判定しました。予防モード（図2a）では、Ac-KLF5模倣KLF5K369Q変異体（すなわち、PC-3-KQ-Luc）を発現する前立腺がん細胞を、最近報告された手順に従って尾の尾動脈を介してマウスに注射した[26]。 ]。パイロット実験によると、細胞注射の 5 週間後、生物発光強度が非常に強かったため、PC-3-KQ-Luc 細胞の骨転移が明らかでした (データは示さず)。

ニタゾキサニドは、前立腺がん細胞における Ac-KLF5 誘発性の骨転移に対して予防効果を発揮します。実験のタイムラインの図。 0日目に、癌細胞（PC-3-KQ-LucまたはPC-3-KR-Luc）を尾尾動脈を介してマウスに注射し、ニタゾキサニドを胃内投与を介して送達した。生物発光強度は 35 日目に測定しました。 b、c PC-3-KQ 細胞 (b) または PC-3-KR 細胞 (c) を保有し、ニタゾキサニド (NTZ) または溶媒対照 (溶媒) を投与されたマウスの生物発光画像 (左) ）。生物発光強度は、関心領域 (ROI) の光子束によって示されます (右パネル、各ドットはマウスの脚を表します)。 n = 12 脚/グループ。 d ニタゾキサニド治療は、PC-3-KQ 細胞によって形成された骨腫瘍領域を大幅に減少させましたが、PC-3-KR 細胞の領域には影響を与えませんでした。大腿骨切片を H&E で染色し、腫瘍細胞の面積と骨切片全体を測定し、NTZ 治療群と対照群間で比較しました。代表的な画像を左側に示し、統計出力を右側に示します。各グループに n = 6 個の腫瘍。 B、骨梁領域。 BM、骨髄領域。 T、腫瘍領域。スケールバー、100μm。すべてのデータは平均値 ± SD として表示されます。 **p < 0.01; ***、p < 0.001; ns、大幅な違いはありません。スチューデントの t 検定による推定

このモデルでは、生物発光シグナルが示すように、腫瘍細胞注射と同時にNTZを投与すると、骨転移が劇的に減少しました（図2b）。一方、PC-3-KR-Luc 細胞ははるかに弱い生物発光シグナルを生成しました (図 2c)。 NTZは、PC-3-KR-Luc細胞の生物発光強度に有意な影響を与えませんでした（図2c）。骨組織切片の骨組織形態計測により、NTZがPC-3-KQ-Luc細胞を有するマウスの腫瘍細胞面積を有意に減少させたことが明らかになりました（図2d）。対照的に、PC-3-KR-Luc細胞を有するマウスは腫瘍領域がはるかに小さく、NTZによる顕著な影響を受けませんでした（図2d）。

NTZ処理マウスの体重は、どのグループでも5週間後に目立った変化を示さなかった（追加ファイル1：図S4a、S4b）。さらに、どのNTZ治療グループでも重篤な有害事象、死亡率、または心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓に顕著な組織病理学的変化を示したマウスは存在しませんでした（追加ファイル1：図S4c）。

治療モードでは、マウスに注射された PC-3-KQ-Luc 細胞を 7 日間放置して骨転移を生じさせた後、NTZ を投与しました。細胞注射の 7 日後、ほとんどのマウスで生物発光シグナルが明らかでした (追加ファイル 1: 図 S5)。マウスは、マウスの生物発光シグナル強度に従って2つのグループに分けられました（図3aおよび追加ファイル1：図S5）。 4週間のNTZ治療後にマウスを分析のために屠殺した。予防モードでの結果と同様に、NTZ 処理により生物発光強度が急激に減少しました (図 3b)。マイクロCT分析により、対照群では骨病変が明らかであったが、NTZ治療によりそのような病変が大幅に減少したことが実証されました（図3c）。骨パラメータの定量分析により、NTZ が BV/TV、Tb を有意に増加させることが明らかになりました。 N、Tb。 Th は Tb を強力に減少させました。 Sp（図3d）。骨組織のH&E切片の定量により、NTZが骨内の腫瘍領域を大幅に減少させたことが確認されました（図3e）。マウスの体重はNTZの影響を受けませんでした（図3f）。

ニタゾキサニド治療は、マウスモデルにおける前立腺がんの溶骨性骨転移を阻害します。実験のタイムラインの図。尾動脈からの注射後、胃内注射により NTZ を投与する前に、腫瘍細胞を 7 日間定着させて増殖させました (1 グループあたり 6 匹のマウス)。 b NTZまたはビヒクルで28日間処理した後のマウスの生物発光画像（左）および強度（右）。 n = 12 脚/グループ。 c 大腿骨と脛骨の代表的なマイクロ CT 画像（左）と大腿骨のマイクロ CT 顕微鏡写真（右の XZ）。白い矢印は、大腿骨骨幹端に形成された骨溶解を示しており、NTZ 治療後に消失しました。 d 組織体積あたりの骨体積（BV / TV、各グループの n = 6 大腿骨）、小柱数（Tb.N、各グループの n = 6 大腿骨）、小柱分離（Tb. Sp、n = 6 大腿骨（対照グループ）、n = 5 大腿骨（NTZ グループ））、および小柱の厚さ（Tb.Th、n = 4 大腿骨（対照グループ）、n = 5 大腿骨（NTZ グループ））。 e 腫瘍細胞 (T)、骨 (B)、および骨髄 (BM) の領域を示す骨切片の H&E 染色 (左)。骨面積に対する腫瘍面積の比率を各マウスについて計算し、右のプロットに示しました。 H&E 画像のスケールバー、100 μm。対照グループでは n = 4 大腿骨、NTZ グループでは n = 5 大腿骨。 f NTZまたはビヒクルによる治療後のさまざまな時点でのマウスの体重。データは平均値 ± SD として表示されます。 **、p < 0.01; ***、p < 0.001; スチューデントの t 検定による推定値。 NTZ、ニタゾキサニド

破骨細胞の分化は、Ac-KLF5 が前立腺がんの骨転移を誘導するために不可欠なメカニズムです [23]。 NTZがAc-KLF5誘導性の破骨細胞分化を減弱させるかどうかを決定するために、我々はまず、破骨細胞分化の細胞株モデルであるRAW264.7細胞におけるNTZの細胞毒性を試験した。 CCK-8細胞生存率アッセイでは、48時間の処理後、NTZは25μM未満の濃度ではRAW264.7細胞において検出可能な細胞毒性を示さなかった（図4a）。 RAW264.7細胞におけるRANKL誘導性の破骨細胞分化は7日間続き、NTZ処理によりTRAP+多核細胞の数が用量依存的に減少した（図4b、c）。 RAW264.7細胞に細胞毒性を引き起こさなかった6.25μMおよび12.5μMのNTZ(図4a)でも、TRAP+多核細胞の数は依然として有意に減少した(図4c)。したがって、NTZ は破骨細胞の分化を弱める可能性があります。

ニタゾキサニドは、Ac-KLF5 誘発の破骨細胞分化を減弱させます。 a CCK8 アッセイで測定した、48 時間処理後の RAW264.7 細胞の生存率に対するさまざまな濃度の NTZ の影響。 b、c RANKL (50 ng/mL) およびさまざまな濃度の NTZ で 5 日間処理した RAW264.7 細胞の TRAP 染色によって確認されたように、NTZ は用量依存的に破骨細胞の分化を阻害します。 TRAP+ 細胞と多核細胞 (核 >3) の代表的な画像 (b) とウェルごとのそれらの数 (c) を示します。データに対して一元配置分散分析を実行しました。 d NTZは、TRAP染色後の細胞の代表的な画像（左）とウェルあたりのTRAP +細胞の数（右）によって示されるように、PC-3-KQ細胞からのならし培地（CM）によって引き起こされるRAW264.7細胞の破骨細胞分化を阻害しました。 NTZ治療。データに対して一元配置分散分析を実行しました。 e NTZ処理後のTRAP染色細胞の代表的な画像（左）およびウェルあたりのTRAP+細胞数（右）によって示されるように、NTZは、PC-3-KQ細胞と共培養したRAW264.7細胞の破骨細胞分化を阻害した。データに対して一元配置分散分析を実行しました。 f TRAP + 細胞を含む骨切片の画像（左）および骨表面（BS）1 mm あたりの破骨細胞数（N.Oc）によって示されるように、NTZ はマウス骨における Ac-KLF5 誘発破骨細胞の数を減少させました。スケールバー、200μm。スチューデントの t 検定を実行しました。ビヒクルグループでは n = 5 大腿骨、NTZ グループでは n = 5 大腿骨。すべての棒グラフについて、データは平均値 ± SD として表示されます。 **、p < 0.01; ***、p < 0.001。 T、腫瘍細胞。 B、骨。 BM、骨髄。 NTZ、ニタゾキサニド; RANKL、核因子-κB リガンドの受容体活性化因子。 TRAP、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ

また、さまざまな濃度 (0、1.25、2.5、および 5 μM) の NTZ で 36 時間処理した PC-3-KQ 細胞から馴化培地 (CM) を収集し、その CM を使用して、さらに希釈したRANKL (10 ng/mL) を7日間投与します。 TRAP+多核細胞の数は、2.5または5μMのNTZで処理した細胞からCMによって有意に減少しました(図4d)。

Ac-KLF5 誘導破骨細胞の 3 番目のモデルは、NTZ (0、1.25、2.5、および 5 μM) の存在下で 7 日間の RAW264.7 細胞と PC-3-KQ 細胞の共培養、およびその後の TRAP でした。染色。共培養は大幅に増加しましたが、3つの濃度すべてのNTZ処理ではTRAP+多核細胞の数が大幅に減少しました（図4e）。マウスの大腿骨では、TRAP染色により、NTZ処理により溶媒グループと比較してTRAP+細胞の数が有意に減少したことが明らかになりました（図4f）。

MMP9 は、骨転移中の骨吸収を含む PCa 転移 [32] において重要です [33]。我々は、Ac-KLF55模倣KLF5K369Qが、アセチル化欠損KLF5K369Rと比較して、タンパク質レベルとmRNAレベルの両方でMMP9発現を有意に誘導し（追加ファイル1：図S6a、S6b）、NTZが用量依存的にMMP9発現を減少させることを発見した。 KLF5K369Q 発現細胞 (追加ファイル 1: 図 S6a、S6b)。 NTZによるMMP9タンパク質発現の減少は、KLF5k369Q誘発性骨転移において免疫組織化学的染色によって確認された（追加ファイル1：図S6c）。したがって、NTZ を介した骨転移の抑制には、NTZ による MMP9 の下方制御も関与している可能性があります。

NTZ がどのように KLF5K369Q 誘発性骨転移を抑制するかを理解するために、NTZ (5 μM) の存在下または非存在下で PC-3-KQ および PC-3-KR 細胞を使用して RNA シーケンスを実行しました。我々は、発現パターンがKLF5K369Qによって調節される遺伝子に焦点を当てたが、KLF5K369Qの調節はNTZ処理によって逆転した。合計で、KLF5K369QとKLF5K369Rの間には2836個の差次的に発現された遺伝子があり、KLF5K369Qによって1779個が上方制御され、1057個が下方制御された（図5a）。 KLF5K369Q によって調節される発現パターンは、2836 個の差次的に発現された遺伝子のうち 241 個について NTZ 処理によって逆転しました。 241個の遺伝子には、KLF5K369Qによって上方制御される127個と下方制御される114個が含まれていました（図5b、c;追加ファイル2：表S3、表S4）。

ニタゾキサニドは、PC-3 細胞における多くの遺伝子の発現に対する Ac-KLF5 の影響を逆転させます。 a PC-3 細胞における KLF5K369Q と KLF5K369R の間の遺伝子発現プロファイルから定量化されたすべての遺伝子のボルケーノプロット。 b NTZ処理ありおよびなしのPC-3-KQ細胞間の差次的発現遺伝子（DEG）およびPC-3-KQ細胞とPC-3-KR細胞間のDEGの散布図。左上の象限のドットは、PC-3 細胞において KLF5K369Q によって下方制御されるが NTZ によって上方制御される遺伝子を表す一方、右下の象限のドットは KLF5K369Q によって上方制御されるが NTZ によって下方制御される遺伝子を示します。調整されたp値<0.05を使用して、すべての変化した遺伝子を定義しました。 c パネル A の左上象限と右下象限の DEG を示すヒートマップ。右側のカラーバーは、log2 倍数変化 (Log2FC) を示します。

我々は、SU2C データベースを使用して、241 個の KLF5K369Q 調節遺伝子および NTZ 応答遺伝子を、その発現レベルと前立腺がん患者の生存との関連について評価しました。生存データは、127 個の KLF5K369Q 上方制御および NTZ 下方制御遺伝子のうち 119 個、および 114 個の KLF5K369Q 上方制御および NTZ 上方制御遺伝子のうち 111 について利用可能でした (追加ファイル 2: 表 S5)。 119個のKLF5K369Q上方制御およびNTZ下方制御遺伝子のうち、MYBL2およびTIMM8Aの上方制御のみが患者OSの悪化と有意に関連しており（図6a）、このパターンはNTZの転移抑制機能と一致している。 INHBB、COL4A6、CACNG8、PIANP、C2orf78を含む5つの遺伝子の上方制御は、OSの悪化ではなくOSの改善と有意に関連していた（追加ファイル1：図S7a）。残りの 112 個の遺伝子の上方制御は、患者の生存に有意な影響を与えませんでした (追加ファイル 2: 表 S5)。したがって、MYBL2 および TIMM8A は、Ac-KLF5 による骨転移の誘導を媒介する可能性が高くなります。

Ac-KLF5 および NTZ 応答遺伝子と患者の生存との関連。 a SU2C データセットを使用したカプランマイヤー分析によって決定されるように、7 つの遺伝子の発現レベルが高いほど、前立腺がん患者の全生存期間 (OS) と相関します。 b GSE21034 データセットを使用して、7 つの Ac-KLF5 および NTZ 応答遺伝子の発現レベルを分析しました [29]。

GSE21034 データセットでは、前立腺がんの原発腫瘍、内臓転移、および骨転移における MYBL2 と TIMM8A の両方の発現レベルが利用可能でした [29]。内臓転移と骨転移を組み合わせると、MYBL2とTIMM8Aの両方が原発腫瘍よりも転移巣で高いレベルで発現しましたが（図6b）、骨転移を個別に分析した場合、MYBL2のみが骨転移で原発腫瘍よりも有意に高い発現レベルを示しました（追加）ファイル 1: 図 S7b)。

SU2C データセット内の 111 個の KLF5K369Q ダウンレギュレーションおよび NTZ アップレギュレーション遺伝子のうち、TMPRSS2、CALB1、SPOCK2、COL4A4、および COL4A3 のレベルが高いほど、OS の改善と有意に関連していました（追加ファイル 1: 図 6a）。ただし、2 つの遺伝子 (FTH1 および BDH1) のレベルが高いほど、患者の OS が悪化することが示されました (追加ファイル 1: 図 S7a)。

さらに、Ac-KLF5がMYBL2およびTIMM8Aを転写調節するかどうかをテストしました。異なる形態のKLF5を発現するPC-3およびDU 145細胞では、定量的RT-PCRにより、PC-3およびDU 145細胞の両方でMYBL2がKLF5K369Qによって有意に誘導されるのに対し、TIMM8Aの誘導は有意ではないことが明らかになった（図7a;追加）ファイル 1: 図 S8a)。 PC-3-KQ細胞においてKLF5がsiRNAによってノックダウンされると、MYBL2の発現はmRNAレベルとタンパク質レベルの両方で大幅に減少しました（図7b、追加ファイル1：図S8b、S8c）。 MYBL2 は、前立腺がんの転移と去勢抵抗性を促進することが最近実証されました [34]。したがって、我々は、KLF5K369Q による MYBL2 のトランス活性化制御に焦点を当てました。

ニタゾキサニドは、前立腺がん細胞における Ac-KLF5 による MYBL2 発現の上方制御を弱めます。 a qPCRを使用して測定した、異なる形態のKLF5を発現するPC-3およびDU 145細胞におけるMYBL2およびTIMM8Aの発現。 C4-2B および親 PC-3 細胞株をコントロールとして使用し、GAPDH をローディングコントロールとして使用しました。統計分析は、多重比較を伴う一元配置分散分析を使用して実行されました。 b 細胞を、NTZ (5 μM) 処理の有無にかかわらず、50 nM siKLF5 で 24 時間トランスフェクトし、その後リアルタイム qPCR を処理しました。統計分析は、多重比較を伴う一元配置分散分析を使用して実行されました。 c qPCRによって検出されたように、NTZはPC-3-KQ細胞およびDU 145-KQ細胞におけるMYBL2発現をmRNAレベルで下方制御した。 NTZ 処理は、示された濃度で 48 時間行われました。統計分析は、多重比較を伴う一元配置分散分析を使用して実行されました。 d マウスにおけるNTZ治療は、IHC染色によって検出され、IHC画像および染色シグナルの強度によって示されるように、PC-3-KQ骨転移におけるMYBL2発現を減少させた。各グループの n = 5 個の腫瘍。スチューデントの t 検定を実行しました。スケールバー、200μm。 e JASPARプログラムによって予測されたように、MYBL2遺伝子プロモーターには複数の潜在的なKLF5結合部位が含まれていました。 f、g NTZは、ChIPおよび通常のRT-PCR（f）またはPCを使用したリアルタイムqPCR（g）によって決定されたように、MYBL2遺伝子プロモーターの異なるAc-KLF5結合部位へのAc-KLF5の結合に対して異なる影響を及ぼしました。 -3-KQ 細胞を NTZ で 48 時間処理し、PC-3-KR 細胞。すべての棒グラフは、3 回の独立した実験の平均 ± SD として示されています。 *、p < 0.05; **、p < 0.01; ***、p < 0.001; ns、統計的に有意ではない

KLF5K369Qを発現するPC-3細胞とDU 145細胞の両方において、NTZ処理により、mRNAとタンパク質の両方でMYBL2の発現が用量依存性または時間依存的に減少しました（図7c、追加ファイル1：図S8d、図S8e）。。免疫組織化学的染色によって明らかになったように、マウスにおけるNTZ処理は、骨組織におけるMYBL2タンパク質発現も有意に減少させた(図7d)。

MYBL2のAc-KLF5誘導転写に対するNTZの効果をさらにテストするために、Jasparソフトウェアを使用してMYBL2のプロモーター配列を分析し、潜在的なKLF5結合部位を特定し（図7e）、6つの潜在的な範囲にわたるプライマーを使用してChIP-PCRを実行しました。結合スコアが最も高い KLF5 結合部位。 -80 と -130 ヌクレオチドの間の 5 つの潜在的な結合部位については、2 対のプライマーを使用しても明らかな結合は検出されませんでした (図 7f)。 -1242 ヌクレオチドと -1251 ヌクレオチドの間の結合部位の可能性について、CHIP-PCR により、MYBL2 プロモーター上の KLF5K369R ではなく、KLF5K369Q の明らかな占有が明らかになりました。 NTZ処理により、KLF5K369Q結合DNAが有意に減少しました（図7fおよびg）。

我々は、さまざまなアッセイを使用して、NTZがKLF5タンパク質に直接結合するかどうかをテストしました（図8）。蛍光消光アッセイでは、NTZは用量依存的にKLF5、KLF5K369Q、およびKLF5K369Rの蛍光強度を減少させ（図8a）、結合定数Kdはそれぞれ7.2、5.4、および7.3μMでした（図8b）。。 CD 分光法では、KLF5 の 3 つの形態すべてが 205 nm と 220 nm の間で負のピークを示し、これはタンパク質の二次構造の修飾を示しています [35]。 NTZ処理により、スペクトル形状は変化せずにこれらの負のピークの強度が減少しました（図8c）。これは、αヘリックス構造の損失を示唆しています。 HPLC分析により、KLF5のアセチル化状態に関係なく、NTZがKLF5タンパク質に結合することも確認された（図8d）。

NTZ は、アセチル化状態に関係なく KLF5 タンパク質に結合します。 a KLF5、KLF5K369Q、および KLF5K369R タンパク質の蛍光強度は、さまざまな濃度の NTZ とインキュベートした後に測定されました。 b Origin ソフトウェアを使用し、蛍光消光データをフィッティングすることによる、解離定数の Kd 値の計算。 c NTZとインキュベートしたKLF5、KLF5K369Q、およびKLF5K369Rの円二色性(CD)スペクトル。タンパク質と NTZ の両方の濃度は 0.2 μM です。 d HPLC分析を使用した、精製されたさまざまな形態のKLF5タンパク質へのNTZの結合

これらの薬物タンパク質結合アッセイでは、Am80 が RARα に結合して、KLF5 に直接結合せずに遺伝子制御における KLF5 との結合を促進するため、合成レチノイド Am80 をネガティブコントロールとして使用しました [36]。 Kdが30μMより大きかったため、Am80は蛍光消光アッセイにおいてどの形態のKLF5タンパク質にも結合しなかった(追加ファイル1:図S9aおよびS9b)。 Am80は、NTZ処理に関係なく、KLF5の二次構造も変化させませんでした（追加ファイル1：図S9c）。

この研究の結果は、寄生虫およびウイルス感染症の治療に現在承認されている薬剤であるニタゾキサニド（NTZ）が、PCa骨転移を治療するための潜在的な治療薬であることを示している[37、38]。この結論の直接的な証拠は動物実験から得られ、NTZ治療は確立されたマウスモデルにおける骨転移の形成、すなわちKLF5K369Q誘発骨転移の形成を劇的に抑制した(図2および3)。 NTZを細胞接種と同時に投与した場合（図2）または1週間後（図3）に投与した場合にも同様の効果が観察されたため、骨転移の抑制は予防モードと治療モードの両方で有効でした。

前立腺がん、乳がん、肺がんは骨に転移することが多い[39、40、41]。乳がんと肺がんは主に溶骨性転移を起こすのに対し、前立腺がんは溶骨性病変と骨芽細胞性病変の両方を引き起こします[39、40、41]。さまざまな要因が、前立腺がん細胞の前破骨細胞活性と前骨芽細胞活性との間のバランスに影響を与える[40、41]。たとえば、骨微小環境では、前立腺がん細胞がRANKLやM-CSFなどの骨関連可溶性因子を分泌して破骨細胞を活性化します。そして破骨細胞は次に TGF-β と IGF-1 を放出して前立腺がん細胞の増殖をサポートします [40、41]。さらに、破骨細胞は副甲状腺ホルモン関連ペプチド（PTHrP）などの骨溶解因子を放出して、骨芽細胞の分化と生存を促進します[39、40]。したがって、破骨細胞の分化は前立腺がんの骨転移において重要な役割を果たしており、破骨細胞の分化を阻害することで前立腺がんの骨転移を効果的に軽減できる可能性があります。我々の以前の研究では、破骨細胞の分化が前立腺癌における溶骨性骨転移を誘発するKLF5K369Qの細胞機構であることが実証された[23]。主に骨の骨芽細胞性病変を促進する C4-2B 細胞でも [42]、KLF5K369Q または KLF5 の異所性発現は依然として溶骨性骨病変を引き起こしました [23]。骨転移に対するその治療効果と一致して、NTZ治療は実際にKLF5K369Q誘発性の破骨細胞分化を減弱させた。このような阻害効果は、破骨細胞分化のin vitroモデル、つまりRANKLで処理またはKLF5K369Q発現癌細胞と共培養したRAW264.7細胞で最初に実証されました（図4b〜e）。破骨細胞に対するNTZの阻害効果は、マウスモデルでも確認されました（図4f）。 RAW264.7細胞に対して細胞毒性を示さなかった濃度でも（図4a）、NTZは依然として破骨細胞を減少させたことは注目に値します（図4b、c）。しかし、前立腺がんは骨芽細胞性病変を誘発することが多いことを考慮すると、NTZが骨芽細胞の分化と機能も阻害するかどうかを調べることは意味があります。

in vitro および in vivo での KLF5K369Q 誘導性の破骨細胞分化の阻害は、NTZ が RANKL 誘導性の破骨細胞形成を阻害することで卵巣摘出マウスの骨量減少を減少させるという最近の研究と一致しています [43]。

分子レベルでは、NTZ は骨転移の阻害における遺伝子転写における KLF5K369Q の機能を直接調節しているようです。 KLF5 は転写因子であり、KLF5K369Q 媒介骨転移は、CXCR4、IL11 など、KLF5K369Q によって転写調節される一連の遺伝子によって媒介されます [23]。 KLF5K369Rと比較して、KLF5K369Qは2836個の遺伝子を上方制御または下方制御した（図5a）。 NTZ処理は、KLF5K369Qによる241個の遺伝子の上方制御または下方制御を逆転させた（図5b、c;追加ファイル2：表S3、表S4）。これらの発見は、NTZ が多くの遺伝子の転写における KLF5K369Q の機能を変化させることを示しています。

複数の遺伝子が、KLF5K369Q 媒介骨転移に対する NTZ の効果を媒介する可能性があります。例えば、Ac-KLF5 で上方制御され、NTZ で下方制御される 2 つの遺伝子、MYBL2 および TIMM8A は、ヒト前立腺がんにおいて上方制御されました。それらの上方制御は、前立腺がん患者の全生存期間の悪化と有意に関連していました（図6a）。 TMPRSS2、CALB1、SPOCK2、COL4A4、およびCOL4A3を含む、ヒト前立腺がんにおける発現レベルの低下も全生存期間の悪化と有意に関連していた5つのKLF5K369Q下方制御遺伝子およびNTZ上方制御遺伝子もあった（図6a）。以前の研究で記載されたCXCR4およびIL11に加えて、これらの7つの遺伝子は、骨転移におけるKLF5K369Qの促進的役割に影響を与える可能性がより高い[23]。

以前の研究で、MYBL2 が前立腺癌の去勢抵抗性増殖と骨転移を促進することが実証されているため、KLF5K369Q 調節遺伝子および NTZ 応答性遺伝子の 7 つのうち、MYBL2 (Myb 関連タンパク質 B) は特に興味深いものです [34]。さらに、MYBL2を標的とすることは、前立腺がん細胞の骨転移をブロックし、MYBL2発現レベルが高いほど、前立腺がん患者における腫瘍ステージの高さ、腫瘍悪性度の高さ、転移再発のリスクの高さ、および予後不良と関連している[34]。 MYBL2 は、がん細胞の細胞周期の進行、生存、分化を制御します [44]。私たちは、前立腺がん細胞において、MYBL2 遺伝子が実際に KLF5K369Q によって転写活性化されていることを発見しました。たとえば、KLF5K369Qは、そのサイレンシングによりMYBL2発現が減少する一方で上方制御され、KLF5K369QはMYBL2プロモーターの特定の配列に結合して転写を活性化しましたが、KLF5K369Rは活性化しませんでした（図7;追加ファイル1：図S8）。さらに、NTZ処理は、培養細胞とマウスで増殖した腫瘍の両方でMYBL2の発現を減少させ、MYBL2プロモーターへのKLF5K369Qの結合を弱めました（図7）。

また、KLF5K369Q が MMP9 発現を上方制御し、その上方制御が NTZ 処理によって減弱されたことも注目に値します (追加ファイル 2: 表 S4; 追加ファイル 1: 図 S6)。活性化された破骨細胞は、酸やマトリックスメタロプロテイナーゼ (MMP) などのプロテイナーゼを生成して骨基質を分解し、骨内でより多くの TGF-β やその他の成長因子を放出します。このような因子は今度は骨転移を刺激し、いわゆる悪循環を引き起こす[45]。したがって、KLF5K369Q発現細胞におけるNTZによるMMP9発現の阻害は、NTZによる骨転移の阻害にも寄与する可能性がある。

さまざまな薬物-タンパク質結合アッセイによって明らかになったように、NTZはKLF5タンパク質に直接作用してその機能を調節すると思われる(図8)。 NTZはKLF5分子に結合しますが、KLF5およびKLF5K369Rも同様の結合能力を示したため、この結合はKLF5K369Qに特異的ではないようです(図8)。 NTZがKLF5にどのように作用するか、またそのような作用が遺伝子転写におけるKLF5の機能に直接影響を与えるかどうかはまだ解明されていない。

骨転移に対するNTZの阻害効果は、骨転移が頻繁に起こる他の種類の悪性腫瘍にも適用される可能性があり、TGF-βは乳癌、肺癌、前立腺癌や多発性骨髄腫などの誘発物質である[46、47]。我々は以前、TGF-βが上皮細胞においてKLF5のアセチル化を誘導し、TGF-βが遺伝子発現や細胞増殖やEMTなどの複数の細胞プロセスを制御するにはKLF5のアセチル化が不可欠であることを報告した[17、18、20、23、48]。 ]。 Ac-KLF5 模倣 KLF5K369Q 変異体は、前立腺がん細胞において EMT を維持し、細胞浸潤を促進し、骨転移を誘導します [23]。したがって、この研究で確立されたKLF5K369Q誘発性骨転移に対するNTZの治療効果は、他の種類の悪性腫瘍におけるTGF-β誘発性骨転移にも当てはまるはずである。

細胞スフェロイド浸潤アッセイにおいて同様に KLF5K369Q 発現細胞の浸潤を抑制した他の薬剤も、骨転移を抑制できる可能性があります。スクリーニング戦略は Cribbes らによって開発されました。以前[24]。骨転移におけるNTZの抑制活性の発見により、KLF5K369Q発現細胞を用いたこのスクリーニング戦略が有効であることが証明された(図1)。 NTZ に加えて、他の 5 つの薬剤も 0.1 μM で細胞スフェロイド浸潤を 50% 以上阻害しました。それらには、ニフラテル、マイトマイシン C、ロニダゾール、レタパムリン、およびフラギンが含まれていました (図 1d、表 1)。マイトマイシン C は転移の治療に広く使用されており [49、50]、ロニダゾールは獣医薬として機能しますが、残りの 3 つの薬剤はいずれも文献で癌転移に関与しているとは示されていません。したがって、これら 3 つの薬剤は、骨転移における潜在的な治療上の役割をテストする価値があります。

NTZ は、原虫感染、駆虫感染、ウイルス感染、細菌感染を含むさまざまな感染症の治療に承認されています [51]。私たちの研究は、前立腺がんの骨転移に対するNTZの治療効果を初めて実証したものですが、その抗がん活性は、さまざまな分子機構を伴うさまざまな種類のがんにおける最近の研究で報告されています。例えば、細胞周期停止を誘導し、複数の分子の発現を変化させることにより、結腸腫瘍の増殖を抑制したと考えられる[52、53]。プロテインジスルフィドイソメラーゼ（PDI）活性を阻害することにより、卵巣がんの増殖を部分的に抑制しました[54]。それは、OXPHOS の阻害を伴う HCC および CRC 細胞の 3D 培養における球体形成を阻害しました [55、56]。そして、G2/M細胞周期停止を引き起こし、アポトーシスを誘導し、おそらくCDK1阻害やING1アップレギュレーションなどを介してオートファジーを阻害することにより、神経膠腫の増殖を抑制した[57、58]。 NTZ はラットにおける MNU による乳腺腫瘍の誘発も防ぐ可能性がある [59]。

分子レベルでは、以前の研究は、NTZ が複数の分子の機能に影響を与え、さまざまなシグナル伝達経路を調節する可能性があることを示唆しています [51]。たとえば、NTZ は、HTS スクリーニングシステムを使用して乳がん細胞の MYC 阻害剤として同定されました [60]。 NTZ は STAT3 経路の中程度の阻害剤として作用する可能性があります [61]。 NTZによるWntシグナル伝達活性の阻害はAPCとは独立している可能性があるが、PAD2ターゲティングとそれに続く結腸癌細胞における脱アミノ化とβ-カテニンの代謝回転の増加が関与している[62]。バイオインフォマティクス分析は、HCC 細胞において NTZ が多くの分子、生物学的プロセス、およびシグナル伝達経路を標的とする可能性があることを示唆しています [63]。 NTZ およびその誘導体の一部による細胞死の誘導には、20S プロテアソームの標的化も含まれます [64]。

要約すると、我々は、前立腺癌においてアセチル化KLF5によって誘導される骨転移を標的とするFDA承認薬を同定するために、最近開発されたスフェロイド浸潤スクリーニングアッセイを採用した。 1987 年の薬剤のうち 6 つは、0.1 μM で細胞スフェロイド浸潤を 50% 以上阻害しました。これらには、ニタゾキサニド、ニフラテル、マイトマイシン C、ロニダゾール、レタパムリン、フラギンが含まれます。機能実験により、マウスにおける予防モードと治療モードの両方で、NTZがKLF5K369Q誘発性骨転移を抑制することが明らかになった。 NTZ は、KLF5K369Q 誘発性の骨転移の原因となる細胞プロセスである破骨細胞形成を阻害しました。機構的には、NTZ は KLF5 分子に結合し、多くの遺伝子の転写における KLF5K369Q の機能を逆転させました。 KLF5K369Q で上方制御される遺伝子と NTZ で下方制御される 2 つの遺伝子、MYBL2 および TIMM8A はヒト前立腺がんで上方制御され、この上方制御は患者の生存率の低下と関連していました。 KLF5K369QによるMYBL2の上方制御にはプロモーターへの直接結合が関与しており、NTZは結合を弱めた。これらの発見は、NTZが前立腺癌においてAc-KLF5によって誘導される骨転移に対する潜在的な治療薬であることを示している。

化合物ライブラリーのスクリーニング結果や RNA 配列解析の結果など、この研究をサポートするデータは補足データファイルに含まれています。現在の研究中に分析されたデータセットは、NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) リポジトリからアクセッション番号 100 で入手できます。 GSE21034、https://identifiers.org/geo:GSE21034。この研究の生の配列データは、受託番号 GSE216126 で GEO に寄託されており、この研究の Web リンクは https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=GSE216126 です。

クルッペル様因子 5

アセチル化KLF5

脱アセチル化 KLF5

前立腺がん

転移性去勢抵抗性前立腺がん

トランスフォーミング成長因子-β

上皮間葉転換

ジメチルスルホキシド

食品医薬品局

ニタゾキサニド

細胞計数キット-8

カルボキシメチルセルロースナトリウム

核内因子-κB の受容体活性化因子

酒石酸耐性酸性ホスファターゼ

誤検出率

がんに立ち向かえ/前立腺がん財団

骨格関連の出来事

最大半値阻害濃度

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動物研究を支援してくださった南方科学技術大学実験動物センターのスタッフに感謝します。

この研究は、深セン市科学技術イノベーション委員会からの助成金 JCYJ20200109141229255 によって支援されています。

Qingqing Huang と Mingcheng Liu はこの研究に等しく貢献しました。

南方科技大学医学部ヒト細胞生物学および遺伝学科、1088 Xueyuan Blvd、深セン、518055、中国

Qingqing Huang、Mingcheng Liu、Duo Zhang、Bing-Biao Lin、Xing Fu、Zhiqian Zhang、Baotong Zhang、Jin-Tang Dong

泌尿器科、腎臓泌尿器科センター、骨盤底障害センター、中山大学第 7 関連病院、深セン、518000、中国

リン・ビンビアオ

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QH、ML、JTD が実験を設計しました。 QH と ML はほとんどの実験を実施し、DZ は KLF5 タンパク質を精製し、薬物-タンパク質相互作用アッセイを支援しました。 QH は実験データを分析しました。 BL と XF はバイオインフォマティクス分析を実行しました。 QH、JTD、ML、BL が原稿を執筆、レビュー、改訂しました。 BZ と ZZ はいくつかの実験計画を支援しました。 JTD はプロジェクトを発案し、研究を監督し、全体的な指導を提供し、原稿を完成させました。著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

ジンタン・ドンへの対応。

すべてのマウスは、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドに従って維持および取り扱いされました。動物実験は、南方科学技術大学実験動物倫理委員会の承認を得て実施されました（承認番号：SUSTC-JY2019030-1）。

適用できない。

著者らは、競合する利益を持たないことを宣言します。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

図1に関連する、さまざまな形態のKLF5発現細胞間の遊走能力と浸潤能力の比較。図S2。アセチル化（KQ）および非変異KLF5細胞浸潤に対するNTZの効果。図1に関連します。図S3。アセチル化KLF5発現細胞における細胞増殖に対するNTZの効果。図1に関連します。図S4。図2に関連して、NTZは生体内で顕著な毒性を引き起こしませんでした。図S5。 7日目の各マウスの再現性BL画像（左）とBL強度分析（右）。図3に関連します。図S6。 NTZ はアセチル化 KLF5 誘導性 MMP9 発現を下方制御しました。図S7。 KQ-Ctrl グループと KR-Ctrl グループ間の差動遺伝子、および 7 つの差動遺伝子の全生存解析。関連する図 5 および図 6。図 S8。ニタゾキサニドは、図7に関連する、アセチル化KLF5誘発性のMYBL2産生を減少させます。図S9。図 8 に関連して、ネガティブコントロールとしての Am80 は、KLF5、KLF5K369Q、および KLF5K369R タンパク質に結合しません。

87 のヒット化合物の二次医薬品スクリーニング。表S2。 25 のヒット化合物の 3 回目の医薬品スクリーニング。表S3。 RNA-Seq における NTZ の影響を受ける差次的遺伝子表S4。 RNA-Seq における NTZ の存在下または非存在下での KR および KQ を含む PC-3 細胞の TPM。表S5。 SU2C データベースにおける NTZ ダウンレギュレーション遺伝子または NTZ アップレギュレーション遺伝子の全生存の重要性。

トリミングされていないイムノブロットまたはゲルの画像。

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転載と許可

Huang, Q.、Liu, M.、Zhang, D. 他。ニタゾキサニドは、前立腺がんにおける KLF5 機能を調節することにより、アセチル化 KLF5 誘発性の骨転移を阻害します。 BMC Med 21、68 (2023)。 https://doi.org/10.1186/s12916-023-02763-4

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受信日: 2022 年 10 月 26 日

受理日: 2023 年 1 月 30 日

公開日: 2023 年 2 月 21 日

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-02763-4

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