ワクシニア E5 は DNA センサー cGAS の主要な阻害剤です

Nature Communications volume 14、記事番号: 2898 (2023) この記事を引用

1035 アクセス

4 オルトメトリック

メトリクスの詳細

DNA センサーの環状 GMP-AMP シンターゼ (cGAS) は、宿主の抗ウイルス免疫に重要です。ワクシニアウイルス (VACV) は、ポックスウイルス科に属する大きな細胞質 DNA ウイルスです。ワクシニアウイルスがどのようにして cGAS を介したサイトゾル DNA 感知経路に拮抗するのかは十分に理解されていません。この研究では、cGAS/インターフェロン遺伝子刺激因子 (STING) 経路の潜在的なウイルス阻害剤を同定するために、80 個のワクシニア遺伝子をスクリーニングしました。我々は、ワクシニア E5 が病原性因子であり、cGAS の主要な阻害剤であることを発見しました。 E5 は、ワクシニアウイルス (Western Reserve 株) の樹状細胞感染時の cGAMP 産生の廃止に関与します。 E5 は感染細胞の細胞質および核に局在します。サイトゾル E5 は、cGAS との相互作用を介して cGAS のユビキチン化とプロテアソーム依存性の分解を引き起こします。改変ワクシニアウイルスアンカラ (MVA) ゲノムから E5R 遺伝子を欠失させると、樹状細胞 (DC) による I 型 IFN 産生が強力に誘導され、DC の成熟が促進され、それによって抗原特異的 T 細胞応答が改善されます。

環状 GMP-AMP シンターゼ (cGAS) は、抗ウイルス、抗腫瘍の自然免疫だけでなく、自己免疫炎症性疾患にも重要な主要な DNA センサーです 1、2、3、4。サイトゾル DNA によって活性化されると、cGAS は環状 GMP-AMP (cGAMP) を生成し、これが小胞体局在タンパク質 STING に結合し、TBK1/IRF3/IFNB 経路の活性化をもたらします。その結果、ウイルスは、この重要な抗ウイルス経路を回避するために多くの戦略を採用するように進化してきました5、6、7、8。

ポックスウイルスは大きな細胞質 DNA ウイルスであり、ヒトおよび獣医学の重要な病原体であるだけでなく、腫瘍溶解性物質やウイルスベクターとしても機能します9、10、11。ワクシニアウイルス (VACV) は、天然痘根絶のためのワクチンとして使用されて成功しました。しかし、樹状細胞 (DC) にワクシニアが直接感染すると、自然免疫応答と適応免疫応答の両方が阻害されます 12、13、14。改変ワクシニアウイルスアンカラ (MVA) は、ニワトリ胚線維芽細胞で 570 以上の連続継代を経た後、親ワクシニアゲノムから大きな断片が欠失し、ほとんどの哺乳動物細胞で複製できなくなる高度に弱毒化されたワクシニア株です 15,16。 MVA は重要なワクチンベクターであり、天然痘およびサル痘に対する第 2 世代ワクチンとして最近承認されました 10,17。

cGAS は、ポックスウイルス感染に対する宿主防御にとって重要です。 cGAS 欠損マウスは、VACV2 による鼻腔内感染や、マウス特異的なポックスウイルスであるエクトロメリアウイルスの足蹠接種に対してより感受性が高くなります 18。ワクシニア B2R 遺伝子は、サイトゾル cGAMP ヌクレアーゼ (ポキシンに改名) をコードしていることが最近発見され、VACV から B2R を欠失させると皮膚傷跡 (SS) モデルが弱毒化されました 19。しかし、ポックスウイルスが cGAS の直接阻害剤をコードしているかどうかは不明のままです。

この研究では、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して、cGAS/STING経路の阻害について80のワクシニアウイルス遺伝子のスクリーニングを実施し、cGAS/STING/IFNB経路の下方制御に関与するタンパク質をコードするいくつかのワクシニア遺伝子を同定した。今回我々は、オルトポックスウイルス間で保存されているBENドメイン含有タンパク質であるE5（E5R遺伝子によってコードされる）20が病原性因子であり、cGASの主要な阻害剤であることを示す。 E5 は細胞質 cGAS と相互作用し、プロテアソーム依存的にその分解を引き起こします。

ワクシニアウイルスは、200 を超えるタンパク質をコードする 190 キロ塩基対 (kbp) のゲノムを持つ大きな細胞質 DNA ウイルスです 21,22。 MVA には親ワクシニアゲノムから約 30 kbp の欠失があり、その結果、多くの免疫調節ウイルス遺伝子が失われます 15。 BMDCのMVA感染はIFN-β分泌とcGAMP産生を誘導しましたが、野生型ワクシニアWR株（WT VACV）感染では誘導できませんでした（図1a、b）。これらの結果は、WT VACV が cGAS 活性化と下流の IFN-β 産生をブロックするウイルス阻害剤をコードしている可能性があることを示唆しています。

MOI 10で16時間、WT VACVまたはMVAのいずれかに感染したBMDCの上清中のIFN-βレベルのELISA分析。細胞溶解物をイムノブロットによって分析しました。 n = 3 個の独立したサンプル。 b MOI 10でWT VACVまたはMVAのいずれかに感染したBMDCにおけるcGAMPレベル。感染後2時間および8時間で細胞を回収した。 cGAMP レベルは LC-MS によって測定されました。 c 異なるワクシニアウイルスにMOI 10で16時間感染させたWTまたはcGas-/-マウスからのBMDCにおけるcGAS、C7、およびE3のイムノブロット。 d 異なるワクシニアウイルスに10のMOIで16時間感染させたWTまたはcGas-/-マウスからのBMDCにおけるIFN-βレベルのELISA分析。 n = 3 個の独立したサンプル。 e MOI 10でWT VACVまたはVACVΔE5Rのいずれかに16時間感染させたWT BMDCにおけるcGAMPレベルのELISA分析。 n = 3 個の独立したサンプル。研究では、対応のない両側スチューデント t 検定を 2 つのグループの比較に使用しました。データは 2 つの独立した実験の代表であり、平均値 ± SEM として表示されます。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

ワクシニアゲノムから潜在的な cGAS 阻害剤を同定するために、我々はまず 80 個のウイルス遺伝子を選択しました。これには、自然免疫のアンタゴニストがウイルスの初期遺伝子によってコードされている可能性が高いという理由から、主にワクシニア感染時の初期に発現する遺伝子が含まれています 21。次に、これらのウイルスタンパク質が cGAS/STING を介したサイトゾル DNA 感知経路を阻害する能力をスクリーニングするためにデュアルルシフェラーゼアッセイを実施しました。以前に報告されたように、同様の戦略を使用して、他の DNA ウイルスによるこの経路の阻害剤をスクリーニングすることに成功しています 5,23。私たちのシステムでは、10 ngのSTINGによるHEK293 T細胞のトランスフェクションはIFNBプロモーター誘導効果が限られていましたが、25 ngのSTINGによるトランスフェクションはIFNB-ホタルルシフェラーゼシグナルを増強しました。これは、cGASなしで大量のSTINGのみがルシフェラーゼシグナルを生成できることを示唆しています（補足図）。 1a)。したがって、潜在的な cGAS 阻害剤を選択する目的で、スクリーニングで STING (10 ng) と cGAS (50 ng) の同時トランスフェクションを使用しました (補足図 1b、c)。アデノウイルス E1A は既知の STING6 阻害剤をコードしており、ワクシニア C7L 遺伝子は最近、IRF3 のリン酸化を防ぐことによって IRF3/IFNB 経路の阻害剤をコードしていることが我々のグループによって報告されました 24。ここで我々は、E1AまたはC7LとSTING（10 ng）およびcGAS（50 ng）との同時トランスフェクションにより、IFNB-ホタルルシフェラーゼシグナルが阻害されることを示しました（補足図1b）。したがって、それらはスクリーニングの陽性対照として選択されました。実際のスクリーニングでは、IFNB-ホタルルシフェラーゼレポーターを発現するプラスミド、ウミシイタケルシフェラーゼを発現するpRL-TKコントロールプラスミド、cGAS（50ng）、STING（10ng）、および示されている個々のワクシニアウイルス遺伝子をHEK293T細胞にトランスフェクトしました。 E1AおよびC7Rも同様です（補足図1c）。このアッセイにより、cGAS / STING経路の潜在的な阻害剤としていくつかのワクシニアウイルスの初期遺伝子（E5R、K7R、B14R、C11R、WR199 / B18R、WR200 / B19R、E4L）が同定されました（補足図1c、d）。候補阻害剤のいずれかが STING を介した IFNB プロモーターの活性化を弱めるかどうかをテストするために、個々の候補遺伝子をより多量 (50 ng) の STING とともに同時トランスフェクトしました。これにより、cGAS を使用せずに IFNB プロモーターが誘導されます。 B14Rを除くすべての候補の過剰発現は、STING（50 ng）誘導性のIFNBプロモーター活性にほとんど影響を及ぼさないことがわかり、B14はSTINGまたはその下流シグナル伝達経路を標的とする可能性がある一方、他の候補はcGASを標的とする可能性があることを示唆しています（補足図1e）。）。これらの遺伝子のうち、WR200/B19R は I 型 IFN 結合タンパク質をコードすることが知られています 25。 K7、B14、および C11 はワクシニア病原性因子として記載されており 26、27、28、WR199/B18R は宿主範囲因子をコードしていると報告されている 29、30 が、それらがどのようにして I 型 IFN 経路を回避するのかは不明である。 E4L はワクシニア RNA ポリメラーゼサブユニット RPO30 および中間転写因子をコードします 31,32。 E5 はウィロソーム (ウイルス工場) に関連するウイルスの初期タンパク質であると報告されていますが 33、それが免疫回避に役割を果たしているかどうかは不明です。

我々は、VACV ゲノムから cGAS/STING 経路の主要な阻害剤を欠失させると、他の欠失変異体や親ウイルスよりも I 型 IFN の誘導が高くなるのではないかという仮説を立てました。このアイデアをテストするために、VACVΔE5R、VACVΔB2R、VACVΔE3L、VACVΔC11R、VACVΔWR199、VACVΔWR200、VACVΔK7R、およびVACVΔC7L。 WTおよびcGAS-/- BMDCにWT VACVおよび欠失変異体を感染させた。ウイルス感染を確認するために、ウイルスタンパク質 C7 および E3 の発現を測定しました (図 1c)。感染したBMDCの上清中のIFN-β濃度をELISAによって測定した。 BMDC の WT VACV 感染は、IFN-β 産生を誘導できませんでした。すべての欠失変異体の中で、VACVΔE5RのみがWT BMDCからのIFN-β分泌を誘導しましたが、cGAS-/- BMDCからは誘導しませんでした（図1d）。 E5RがE5R-Flagに置き換えられたVACVΔE5R-E5R-FlagはIFN-β分泌を誘導できず、E5R-Flagが生物学的に活性であることを示しています（図1d）。さらに、B2（B2R遺伝子によってコードされる）はcGAMPヌクレアーゼ19として同定されましたが、VACVΔB2R感染はWT BMDCからのIFN-β分泌を誘導しませんでした（図1d）。これは、cGAS / STINGの他のウイルス阻害剤の存在を示唆しています。 VACVΔB2Rの/IFNB経路。さらに、WT BMDCのVACVΔE5R感染はcGAMP産生を誘導し、cGASの活性化を示しました（図1e）。これらの結果は、ワクシニア E5R が cGAS の主要な阻害剤をコードしていることを示しています。

ワクシニア E5 は、N 末端のアルファヘリックスドメイン (アミノ酸 60 ～ 106) と C 末端の 2 つの BEN ドメイン (アミノ酸 112 ～ 222 およびアミノ酸 233 ～ 328) を含む 341 アミノ酸のポリペプチドです (補足図) .2a)。 BEN は、BANP/SMAR1、ポックスウイルス E5R、および NAC120 に存在することにちなんで名付けられ、BEN ドメイン含有タンパク質は DNA 結合、クロマチン組織化、および転写抑制において機能します 34,35,36。 E5Rはオルソポックスウイルス間で保存されていますが（補足図2b、c）、ヤタポックスウイルスと粘液腫ウイルスの間ではそれほど保存されていません。しかし、E5Rオルソログは、パラポックスウイルス、昆虫ポックスウイルス、鶏痘ウイルス、および伝染性軟属腫ウイルスには存在しません（データは示されていません）。ワクシニア（ウェスタンリザーブ（WR）株およびコペンハーゲン株）、痘瘡（天然痘の原因物質）、および牛痘ウイルス由来の E5 タンパク質には、ワクシニア（アンカラ）由来の E5 タンパク質と比較して、N 末端に 10 個の余分なアミノ酸配列が含まれています。）、MVA、およびエクトロメリア（ネズミ痘）（補足図2c）。興味深いことに、Monkeypox E5 には、N 末端と C 末端の両方に大きな欠失があります (補足図 2c)37。

ワクシニア E5 が病原性因子であるかどうかをテストするために、WT C57BL/6J マウスで WT VACV または VACVΔE5R (2 × 106 pfu) を用いた鼻腔内感染実験を実施しました。 WT VACVに感染したマウスはすべて、感染3日目から急速に体重が減少し、感染後7〜8日で30％を超える体重減少により死亡するか安楽死させられました（図2a、b）。対照的に、VACVΔE5Rに感染したマウスは、感染後6日目に平均で初期体重の15％近く減少し、その後回復しました（図2a、b）。 VACVΔE5Rの複製が減衰している可能性を排除するために、BSC40細胞におけるWT VACVとVACVΔE5Rの間でプラークサイズと複製動態を比較しました。 VACVΔE5Rは複製能力があり、in vitroでWT VACVと同様の複製動態を示すことがわかりました（補足図3a、b）。しかし、2 × 105 pfu の WT VACV の鼻腔内感染では、VACVΔE5R (2 × 107 pfu) から採取された組織と比較して、感染後 6 日目の感染した肺、脾臓、肝臓、および血液の力価がはるかに高くなりました。感染後6日目にC57BL / 6Jマウスに感染しました（補足図3c）。これらの結果は、VACVΔE5Rがin vitroではWT VACVと同様の複製能力を有するが、おそらくVACVΔE5R感染によって誘導される宿主の自然免疫応答により、in vivoでは減弱されることを示している。 VACVΔE5R感染後のさまざまな組織におけるウイルス力価の低下は、感染動物の体重減少の減少および生存率の向上と相関しています（図2a、b）。これらの結果は、VACVΔE5RがWT VACVと比較して弱毒化されていることを示し、したがってE5が病原性因子であることを実証している。さらに、VACVΔE5R (2 × 107 pfu) は、cGas-/- または Stinggt/gt マウスでは毒性を獲得しましたが、Mda5-/- マウスでは弱毒化されたままであり、cGAS または STING によって媒介されるサイトゾル DNA センシング経路が宿主にとって不可欠であることを示しています。 VACVΔE5Rによる鼻腔内感染に対する防御（図2c、d）。さらに、VACVΔE5R感染の48時間後に気管支肺胞洗浄液（BALF）でIFN-βを検出しました（図2e）。これは、VACVΔE5R感染による鼻腔内感染がin vivoでIFN-β産生を誘導できることを示しました。

a、b WT C57BL/6J マウス（各グループ n = 5）の、1 用量の WT VACV または VACVΔE5R による鼻腔内感染後の日数にわたる初期体重（a）およびカプラン・マイヤー生存曲線（b）の割合マウスあたり 2 × 106 pfu。 c、d 鼻腔内投与後の日数にわたるWT、Mda5-/-、cGas-/-、またはStinggt / gtマウス（各グループn = 5）の初期体重（c）およびカプラン・マイヤー生存曲線（d）の割合（d）マウスあたり 2 × 107 pfu の用量で VACVΔE5R を感染させます。 e マウス1匹あたり2×107 pfuの用量でWT VACVまたはVACVΔE5Rを感染させて48時間後にWTマウスから採取したBALF中のIFN-βレベルのELISA分析。 n = 5 個の独立したサンプル。 f VACV E5R全長復帰変異体およびさまざまなVACV E5Rトランケーション変異体の概略図。 g VACV、VACVΔE5R、VACV-E5R-FL復帰変異体、およびさまざまなVACV E5R切断変異体を含む、さまざまなワクシニアウイルスに感染したWT BMDCにおけるIfnbレベルのMOI 10で6時間のRT-qPCR分析。 n = 3 個の独立したサンプル。 h、i VACVΔE5R、VACV-E5R全長による鼻腔内感染後の数日間にわたるWT C57BL/6Jマウス（各グループn = 5）の初期体重の割合（h）およびカプラン・マイヤー生存曲線（i）復帰変異体、およびさまざまな E5R 切断変異体には、マウス 1 匹あたり 2 × 107 pfu の用量。研究では、対応のない両側スチューデント t 検定を 2 つのグループの比較に使用しました。データは平均値 ± SEM として表示されます。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

E5のどのドメインがIFNB誘導および病原性のE5媒介阻害に必要であるかを決定するために、VACV-E5R（全長; FL）およびその一連の切断変異体を構築しました（図2f）。 BMDC は、WT VACV、VACVΔE5R、VACV-E5R-FL、および E5R 切断変異体に感染しました。ワクシニアC7発現は、ウイルス感染を検証するためにウェスタンブロット分析によって決定されました（補足図3d）。定量的リアルタイム PCR を使用して、感染した BMDC における Ifnb1 遺伝子発現を測定しました。 VACV-E5R（全長）はBMDC細胞においてIfnb1遺伝子発現を穏やかに誘導しただけであったが（図2g）、すべてのE5R切断変異体はVACVΔE5Rと同様のレベルでIfnb1遺伝子発現を誘導した（図2g）。さらに、C57BL/6J マウスにおける VACV-E5R (全長) および E5R トランケーション変異体 (2 × 107 pfu) の鼻腔内感染では、VACV-E5R (全長) 感染のみが致死的であり、すべてのトランケーション変異体は致死性であることが示されました。一時的な体重減少はあるが、VACV-E5RΔ224N (80% 生存) を除いて 100% 生存 (図 2h、i)。これらの結果は、N 末端アルファヘリックスドメインと 2 つの BEN ドメインを含むすべての E5 ドメインが、Ifnb 遺伝子発現と病原性の抑制に必要であることを実証しました。

MVA ゲノムの E5R 遺伝子が機能的なタンパク質をコードしているかどうかを調べるために、MVAΔE5R を生成しました。 BMDCのMVAΔE5R感染はIfnb1、Ifna、Ccl4、およびCcl5遺伝子発現を強力に上方制御しました（図3a）が、MVA感染の誘導は緩やかでした。 BMDCのMVAΔE5R感染は、MVA、熱不活化MVA（heat-iMVA）、または熱不活化MVAΔE5R（heat-iMVAΔE5R）よりもはるかに高いレベルのIFN-β分泌を誘導しました（図3b）。ワクシニア E3L 発現は、MVA と MVAΔE5R の間で同等でした (図 3c)。 E3L 遺伝子発現は、予想されたように、熱不活化 MVA (Heat-iMVA) または熱不活化 MVAΔE5R (Heat-iMVAΔE5R) に感染した BMDC では検出されませんでした。 BMDCにおけるIFN-βの誘導はウイルス量に依存しました（補足図4a）。 IFN-α分泌は、BMDCにおけるMVAΔE5R感染によっても強く誘導されました（図3d）。さらに、MVAΔE5Rは、BMDCにおいてMVAよりもはるかに高いレベルのcGAMP産生を引き起こし（図3e）、E5がcGASを標的とすることを示唆しています。

MVAまたはMVAΔE5Rのいずれかに感染したWT BMDCにおけるIfnb1、Ifna、Ccl4、およびCcl5遺伝子発現のMOI 10で6時間のRT-qPCR。 n = 3 個の独立したサンプル。 b MOI 10で16時間、MVA、MVAΔE5R、Heat-iMVA、またはHeat-iMVAΔE5Rに感染させたWT BMDCの上清中のIFN-βまたはIFN-αレベルのELISA分析。 n = 3 個の独立したサンプル。 c MOI 10で16時間、異なるワクシニアウイルスに感染したWT BMDCにおけるE3遺伝子発現のRT-qPCR分析。 n = 3 個の独立したサンプル。 d MOI 10で16時間MVAまたはMVAΔE5Rに感染させたWT BMDCの上清中のIFN-αレベルのELISA分析。 n = 3 個の独立したサンプル。 e MOI 10で16時間、MVAまたはMVAΔE5Rに感染したWT BMDCにおけるcGAMPレベルのELISA分析。 n = 3 個の独立したサンプル。 f MVAまたはMVAΔE5Rに感染したWT、cGas-/-、Stinggt/gt、Irf3-/-、およびIrf7-/-マウスからのBMDCにおけるIFN-βレベルのELISA分析。MOI 10で16時間。 n = 3 個の独立したサンプル。 ***p < 0.001。研究では、対応のない両側スチューデント t 検定を 2 つのグループの比較に使用しました。データは平均値 ± SEM として表示されます。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

BMDCと同様に、骨髄由来マクロファージ（BMM）または初代真皮線維芽細胞のMVAΔE5R感染も、MVAよりもはるかに高いレベルのIFN-β分泌を誘導しました（補足図4b、c）。これらの結果は、ワクシニア E5 が cGAS 活性化をブロックし、MVA ゲノムからの E5R の欠失が複数の骨髄細胞型において cGAS/STING 経路を強力に活性化することを実証しました。さらに、MVAΔE5Rによって誘導されるBMDCからのIFN-β分泌は、cGAS-/-またはSTINGGt/Gt細胞では廃止され、IRF3-/-またはIRF7-/-細胞では減少しました（図3f）。 BMDCに加えて、BMMまたは初代線維芽細胞におけるMVAΔE5R誘発性のIFN-β分泌もcGAS / STING経路に依存していました（補足図4b、c）。これらの結果は、cGAS/STING 媒介サイトゾル DNA センシング経路と転写因子 IRF3 および IRF7 が、さまざまな初代細胞型における MVAΔE5R 誘導性の IFN-β 分泌に必要であることを示しています。

入ってくるビリオンによって提供される親ウイルス DNA に加えて、ウィロソーム内での DNA 複製後に生成される子孫ウイルス DNA もサイトゾル DNA センサー cGAS を刺激し、IFN-β 産生を引き起こす可能性があります。これを評価するために、ホスホノアセテート (PAA) またはアフィジコリンを使用してウイルス DNA 複製をブロックしました 38,39。 MVAΔE5R感染MEFのPAAまたはアフィジコリン処理は、予想どおりウィロソーム形成をブロックし（補足図4d）、A27やA34などのウイルス後期遺伝子の発現を廃止しました（補足図4e）。 MVAΔE5Rによって誘導されるIfnb1遺伝子発現とIfna遺伝子発現は両方とも、PAAまたはアフィジコリンの存在下では部分的に減少しました（補足図2e）。全体として、我々の結果は、MVAΔE5R に感染した BMDC からの親ウイルス DNA と子孫ウイルス DNA の両方が I 型 IFN 誘導に寄与していることを示しています。

E5 が cGAS/STING 経路にどのように拮抗するかを調べるために、まず WT VACV 感染後の cGAS タンパク質レベルを評価しました。 BMDCにおけるWT VACV感染後6時間のcGASタンパク質レベルは、模擬感染対照と比較して低いことが観察され（図4a）、cGASタンパク質がウイルス感染後に分解される可能性があることを示唆しています。プロテアソーム阻害剤MG132による処理はcGASの分解を防止しましたが、汎カスパーゼ阻害剤Z-VADまたはAKT1/2阻害剤VIIIによる処理はcGASレベルにほとんど影響を与えませんでした（図4a）。タンパク質翻訳阻害剤シクロヘキシミド（CHX）による処理はcGAS分解を部分的にブロックし、新たに合成されたウイルスタンパク質がcGAS分解を促進する可能性があることを示唆しました（図4a）。感染細胞のワクシニア C7 タンパク質レベルを使用して、感染と薬剤の効果を検証しました。例えば、C7タンパク質は、CHXの存在下でWT VACVに感染した細胞には存在しなかった(図4a)。これらの結果は、WT VACV 誘発 cGAS 分解がプロテアソーム依存性であることを示しています。 WT VACVとは異なり、BMDCのVACVΔE5R感染はcGASの分解を引き起こしませんでした（図4b）。同様に、BMDCのMVA感染はcGAS分解を引き起こしましたが、MVAΔE5R感染は引き起こさなかったので（図4c）、E5がVACVまたはMVA感染のいずれかの状況においてcGAS分解に寄与していることが確認されました。

MOI 10で6時間WT VACVに感染したMEFにおけるcGASの免疫ブロット。細胞をシクロヘキシミド (CHX、25 μg/mL)、プロテアソーム阻害剤 MG132 (25 μM)、汎カスパーゼ阻害剤 Z-VAD (50 μM)、AKT1/2 阻害剤 VIII (10 μM) で 30 分間前処理した後、それぞれの薬物の存在下での WT VACV。感染後6時間で細胞を収集しました。 b、c 示されたウイルスにMOI 10で感染したBMDCにおけるcGASの免疫ブロット。ウイルスに感染する前に、細胞をMG132（25μM）の有無にかかわらず30分間前処理しました。感染後の指定された時間に細胞を収集しました。 d BMDCをMOI 10でMVAに感染させた。示された時点で細胞を収集し、総ユビキチン化タンパク質をHalo-4xUBAUBQLN1ビーズによってプルダウンした。ユビキチン化 cGAS は抗 cGAS 抗体によって検出されました。 mUB-cGAS モノユビキチン化 cGAS、Poly-UB-cGAS ポリユビキチン化 cGAS、PD プルダウン。 e HEK293T 細胞に、V5-cGAS および HA-Ub (WT または K48 のみ) 発現プラスミドを同時トランスフェクトしました。 24時間後、MG132（25μM）の存在下で細胞をMOI 10で6時間MVAまたはMVAΔE5Rに感染させた。 cGAS は抗 V5 抗体によってプルダウンされ、ユビキチン化 cGAS は抗 HA 抗体によって測定されました。 IP免疫沈降。 WCL 全細胞溶解物。 f MOI 10で6時間MVAΔE5R-E5-FlagまたはMVAΔE5R-E5R95K-Flag感染後のBMDCにおけるE5-Flagの位置を示す代表的な共焦点画像。 E5-Flagは抗Flag抗体により染色されました。スケールバー、50μm。 g MVAΔE5R-E5-FlagまたはMVAΔE5R-E5R95K-FlagをMOI 10で6時間感染させたBMDCからの細胞質および核抽出物中のE5-Flagの免疫ブロット。 CE 細胞質抽出物、NE 核抽出物。 h MOI 10で16時間、MVA、MVAΔE5R、MVAΔE5R-E5-FlagまたはMVAΔE5R-E5R95K-Flagに感染させたBMDCの上清中のIFN-βレベルのELISA分析。 n = 3 個の独立したサンプル。研究では、対応のない両側スチューデント t 検定を 2 つのグループの比較に使用しました。データは2回（f）または3回（a〜e）の独立した実験の代表であり、平均値±SEMとして表示されます。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

BMDC の MVA 感染が内因性 cGAS のユビキチン化を引き起こすかどうかをテストするために、MG132 の存在下、指定された時間、BMDC を MOI 10 で MVA に感染させました。 MVA 感染 BMDC からの総ユビキチン化タンパク質は、ユビキチン化タンパク質を特異的にプルダウンするユビキリン 1 の 4 つのタンデムユビキチン関連 (UBA) ドメインを含む Halo-4×UBAUBQLN1 ビーズによって濃縮されました 40。モノユビキチン化およびポリユビキチン化 cGAS バンドは両方とも、感染後 2 時間という早い段階で検出され、感染後 4 時間および 6 時間で増加しました (図 4d)。このユビキチン化パターンは、cGAS 分解の動態と相関していました。また、すべてのサンプルで未修飾 cGAS も検出されました。これは、おそらく未修飾 cGAS のビーズへの非特異的結合および/またはユビキチン化 cGAS とのオリゴマー複合体の形成によるものと考えられます。

我々は、ワクシニア E5 が cGAS のユビキチン化とそれに続くプロテアソーム依存性の分解を誘導するのではないかという仮説を立てました。それをテストするために、HEK293T 細胞に V5-cGAS および HA-Ub (WT または K48 のみ) 発現プラスミドを同時トランスフェクトしました。 24時間後、MG132の存在下で細胞をMVAまたはMVAΔE5Rに感染させた。 cGAS は抗 V5 抗体によってプルダウンされ、ユビキチン化 cGAS は抗 HA 抗体によって測定されました。 MVAΔE5Rに感染した細胞と比較して、MVAに感染した細胞ではより高いレベルのcGASユビキチン化、特にK48関連ポリユビキチン化が検出されました（図4e）。したがって、我々の結果は、MVAによって発現されたE5がcGASのK48結合ポリユビキチン化を促進し、その分解を引き起こすことを示唆している。

E5 発現を視覚化するために、組換えウイルス MVAΔE5R-E5-Flag を生成しました。 MVAΔE5R-E5-Flagに感染したBMDCの共焦点イメージングにより、E5の細胞質と核の両方の局在が示されました（図4f）。ウェスタンブロット分析により、E5が細胞質と核の両方で発現していることが確認されました（図4g）。 GAPDH を細胞質タンパク質のポジティブコントロールとして使用し、ラミン B1 を核タンパク質のポジティブコントロールとして使用しました。さらに、BMDCのMVAΔE5R-E5-Flag感染は、MVAΔE5Rよりもはるかに低いIFN-β産生をもたらし（図4h）、タンパク質のC末端にあるFlagによるE5のタグ付けが、BMDCの阻害機能を保持していることを示しています。 cGAS/STING 経路。薬物選択を使用して MVAΔE5R-E5-Flag ウイルスを生成する過程で、単一ヌクレオチド変化 (G284A) を含む 1 つの変異株 MVAΔE5R-E5R95K-Flag を単離しました。これにより、アミノ基のアルギニンが置換されます。リジンによるE5の酸95。 E5R95K-Flagは細胞質で発現されましたが、MVAΔE5R-E5R95K-Flag感染BMDCの核には発現されませんでした（図4f）。ウェスタンブロットにより、BMDCにおけるMVAΔE5R-E5R95K-Flag感染後、核E5R95K-Flagタンパク質のみが検出され、核では検出されないことが確認されました（図4g）。さらに、MVAΔE5R-E5R95K-Flagに感染したBMDCではIFN-β産生が減少しました（図4h）。これは、MVAΔE5R-E5-FLAGに感染したBMDCによって産生されるものと同様であり、細胞質E5が十分であることを示していますI型IFNの産生を抑制します。

E5 単独がウイルス感染なしで cGAS 分解を引き起こすことができるかどうかをテストするために、cGAS 発現プラスミドを E5R 発現プラスミドまたは空のベクターとともに HEK293T 細胞に同時トランスフェクトしました。 24時間後、細胞をMOI 10で6時間MVAΔE5Rに感染させた。 E5R発現プラスミドによる共トランスフェクション後にはcGASレベルが減少したが、空のベクターでは減少しなかったことを観察した（図5a）。さらに、MVAΔE5R感染はE5媒介cGAS分解を促進できませんでした（図5a）。これは、おそらくプラスミドトランスフェクションの状況において、E5単独がcGAS分解を引き起こす可能性があることを示しています。次に、MEF におけるレンチウイルス形質導入を介した E5 の過剰発現によっても cGAS が分解されるかどうかをテストしました。 MEF には、mcherry または E5-Flag を発現するレンチウイルスベクターのいずれかを導入しました。 48 時間後、細胞溶解物を収集し、cGAS 発現を測定しました。 E5-Flagの過剰発現により、MEFの内因性cGASレベルも低下することが観察されました（図5b）。

a HEK293T 細胞に V5-cGAS および pcDNA-E5R-Flag または pcDNA3.1 プラスミドを同時トランスフェクトしました。 24時間後、細胞をMOI 10でMVAΔE5Rに6時間感染させた。 V5-cGAS タンパク質レベルは、抗 V5 抗体によって測定されました。 C7 タンパク質が測定され、MVAΔE5R 感染が示されました。 b MEF細胞を、E5R-Flagまたはmcherryを発現するレトロウイルスに感染させた。 48時間後、cGASタンパク質レベルを抗cGAS抗体によって測定した。 c HEK293T 細胞を V5-cGAS および pcDNA-E5R-Flag または pcDNA3.1 プラスミドでトランスフェクトしました。 24 時間後、細胞溶解物をベンゾナーゼ (250 U/mL) の有無にかかわらず処理しました。 V5-cGAS は抗 V5 抗体によってプルダウンされ、E5-Flag は抗 Flag 抗体によって決定されました。 d WTまたはcGas-/-マウスからのBMDCを、MOI 10で6時間MVAΔE5R-E5R-Flagに感染させた。細胞溶解物をベンゾナーゼ (250 U/mL) の有無にかかわらず処理しました。 cGAS は抗 cGAS 抗体によってプルダウンされ、E5-Flag は抗 Flag 抗体によって決定されました。 e MOI 10で6時間MVAΔE5R-E5-Flag感染させた後のBMDCにおけるE5-FlagおよびcGASの位置を示す代表的な共焦点画像。 E5-Flagは抗Flag抗体により染色されました。内因性 cGAS は抗 cGAS 抗体によって染色されました。スケールバー、15μm。 f HEK293T 細胞を V5-cGAS および pcDNA-E5R-Flag または pcDNA3.1 プラスミドでトランスフェクトしました。 24 時間後、MG132 (25 μM) で 6 時間処理した後に細胞を回収し、Halo-4xUBAUBQLN1 ビーズによって総ユビキチン化タンパク質をプルダウンしました。ユビキチン化 cGAS は抗 cGAS 抗体によって検出されました。 mUB-cGAS モノユビキチン化 cGAS、Poly-UB-cGAS ポリユビキチン化 cGAS、PD プルダウン。 g ワクシニア E5 の実用モデルは細胞質 cGAS に拮抗します。データは2回（e）または3回（a〜d）の独立した実験の代表であり、平均値±SEMとして表されます。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

E5 と cGAS が相互作用するかどうかを評価するために、HEK293T 細胞に V5-cGAS および E5-Flag 発現プラスミドをトランスフェクトしました。抗 V5 抗体による免疫沈降により E5-Flag がプルダウンされたため、E5-cGAS 相互作用が示されました (図 5c)。 E5 と cGAS の相互作用を媒介するために DNA が必要かどうかをテストするために、DNA と RNA の両方を除去するエンドヌクレアーゼであるベンゾナーゼを使用または使用せずに細胞溶解物を処理しました。ベンゾナーゼ処理はE5-cGAS相互作用を破壊できず、このような相互作用はDNAによって媒介されないことを示しています（図5c）。次に、MVAΔE5R-E5-Flag によって発現された E5-Flag が BMDC 内の内在性 cGAS と相互作用するかどうかをテストしました。簡単に説明すると、WT および cGAS-/- BMDC を MVAΔE5R-E5-Flag に MOI 10 で 6 時間感染させました。細胞溶解物はベンゾナーゼの有無にかかわらず処理されました。 cGAS は抗 cGAS 抗体によってプルダウンされ、E5-Flag は抗 Flag 抗体によって決定されました。免疫共沈降アッセイは、WT BMDCではcGASがE5-Flagと相互作用し、ベンゾナーゼ処理が相互作用を破壊できないことを示しました（図5d）。我々は、cGAS-/- BMDC ではそのような相互作用を検出できませんでした。また、MVAΔE5R–E5-Flagに感染したBMDCにおけるE5-Flagと内因性cGASの共局在を視覚化しました（図5e）。さらに、cGASおよびE5R発現プラスミドをHEK293T細胞に同時トランスフェクションすると、cGAS単独よりも強力なcGASユビキチン化が促進されました（図5f）。 HEK293T、MEF、BMDC などのいくつかの哺乳類細胞タイプにおけるプラスミドトランスフェクション、レンチウイルス形質導入、MVAΔE5R–E5-Flag 感染アプローチを総合的に使用して、DNA 結合に依存しない E5 と cGAS 間の相互作用を実証しました。我々の結果は、E5がプロテアソーム依存性機構を介してcGASのユビキチン化とその後の分解を促進することも示しています（図5g）。

MVA は、HIV、結核、マラリア、エボラ出血熱、SARS-CoV-2 などのさまざまな感染症のワクチンベクターとして研究されており 10、MVA 感染はヒト単球由来 DC (moDC) を適度に活性化します 41。 E5R欠失がウイルスベクターの免疫原性を改善するかどうかを調べるために、最初にモデル抗原ニワトリオボアルブミン（OVA）を発現するMVAΔE5R-OVAを生成し、次にMVAΔE5R-OVA対MVA-OVA感染時のDC成熟を比較しました。 MVAΔE5R-OVA感染は、感染後24時間でMVA-OVAと比較してより高いレベルのCD86およびCD40発現を誘導したことを観察しました（図6a〜c）。しかし、MVAΔE5R-OVA および MVA-OVA 誘導性の CD86 および CD40 発現はいずれも cGAS-/- BMDC で減少しており、MVAΔE5R-OVA または MVA-OVA 誘導性の DC 成熟にはサイトゾル DNA 感知経路が不可欠であることが示されています。 (図6a～c)。

a – c MVA-OVAまたはMVAΔE5R-OVAをMOI 10で16時間感染させたWTまたはcGas-/- BMDCにおけるCD86およびCD40発現の代表的なフローサイトメトリードットプロット（a、b）または分析（c）。 n = 3 個の独立したサンプル。 d MVAまたはMVAΔE5RによるWTまたはcGas-/- BMDC感染における選択された免疫関連遺伝子の相対発現を示すヒートマップ。これらには、抗原提示、DC 活性化、IFN、炎症誘発性サイトカインおよびケモカイン、自然免疫センサーに関与する遺伝子が含まれます。 e MVA-OVAまたはMVAΔE5R-OVAによるワクチン接種後の抗原特異的T細胞反応。 C57BL/6J マウスに、皮膚切開 (SS) または皮内注射 (ID) を介して MVA-OVA または MVAΔE5R-OVA をワクチン接種しました。 1週間後、脾臓および流入リンパ節（dLN）を採取し、脾細胞中のSIINFEKL特異的CD8+ T細胞およびリンパ節中のOVAテトラマー特異的CD8+またはTh1 CD4+ T細胞をFACSによって測定した。 n = 5 個の独立したサンプル。研究では、対応のない両側スチューデント t 検定を 2 つのグループの比較に使用しました。データは平均値 ± SEM として表示されます。ソースデータはソースデータファイルとして提供されます。

MVA または MVAΔE5R に感染または模擬感染した WT または cGAS-/- BMDC の RNA-seq 分析により、WT BMDC における MVAΔE5R 感染が、より高いレベルの I 型 IFN および炎症誘発性サイトカインおよびケモカイン遺伝子を誘導することが実証されました。 Ifnb1、Ccl5、Ccl12、Il12b、Il6、Il27、DC 成熟および活性化マーカー (CD86、CD40、CD69 など)、および抗原交差提示に関与する遺伝子 (Tap1、H2-Q4、H2-Q6、H2 など) -Q7、MVAと比較（図6dおよび補足図5a、b）。 MVAとMVAΔE5Rの両方によるこれらの遺伝子の上方制御はcGAS依存性でした（図6dおよび補足図5a、c）。

次に、MVA-OVA または MVAΔE5R-OVA のいずれかを SS または皮内 (ID) 注射することによりワクチン接種を実行しました。ワクチン接種の 1 週間後、脾臓および所属リンパ節の抗 OVA CD8+ および Th1 CD4+ T 細胞を分析しました。 MVAΔE5R-OVAによるワクチン接種により、脾臓においてMVA-OVAよりも多くのOVA特異的CD8+ T細胞が生じた（図6e）。また、MVA-OVAと比較して、MVAΔE5R-OVAワクチン接種後の流入リンパ節（dLN）では、より多くのOVA特異的CD8 + またはTh1 CD4 + T細胞が検出されました（図6e）。これらの結果は、MVA から E5R 遺伝子を欠失させると、ワクチン接種後の抗原特異的 T 細胞応答が増加するという証拠を提供します。

ワクシニア E5 がサイトゾル DNA センサー cGAS の主要な阻害剤であることが同定されたことは、ポックスウイルス感染に対する宿主防御におけるその経路の重要性を浮き彫りにしています。 BEN ドメインファミリーの創設メンバーである E5 は、オルトポックスウイルスの間で保存されています。今回我々は、病原性因子E5がcGASに結合してcGASのユビキチン化とプロテアソーム依存性の分解を引き起こすこと、またMVAウイルスベクターからE5Rを欠失させるとその免疫原性が向上することを示す。

VACV (WR およびコペンハーゲン株)、牛痘ウイルス、およびエクトロメリアウイルスを含む毒性のポックスウイルスは、高度に弱毒化された誘導体である MVA42,43 とは異なり、STING を活性化できません。さらに、BMDC の WT VACV 感染ではなく MVA 感染は cGAMP 産生を誘導することから、VACV が cGAS の阻害剤をコードしていることが示唆されます。 80 個のワクシニア遺伝子の公平なスクリーニングを通じて、E5R、K7R、C11R、WR199/B18R、および WR200/B19R を含む、cGAS 阻害剤をコードする可能性のあるいくつかの候補遺伝子を同定しました。次に、E5Rを欠くVACV変異体はBMDCにおいて中程度の量のIFN-β分泌とcGAMP産生を誘導する一方、他の個々の候補遺伝子（B2R、E3L、C11R、WR199、WR200、K7R、およびC7Lを含む）を欠くVACV変異体はE5Rに焦点を当てた。 ) BMDC では IFN-β 分泌を誘導できませんでした。我々の条件では、cGAMPヌクレアーゼをコードするB2R遺伝子を欠くVACVはBMDCにおけるI型IFN産生を誘導できず、cGAS/STING経路に拮抗するワクシニアウイルスタンパク質がさらに存在する可能性を示唆している。

野生型 VACV とは異なり、骨髄由来樹状細胞の MVA 感染は cGAS/STING 依存的に I 型 IFN を誘導します 43。私たちの研究は、MVA から E5R 遺伝子を除去すると、BMDC、BMM、および初代線維芽細胞における I 型 IFN の誘導が劇的に増強されるため、MVA の E5 が依然として機能していることを示しました。一方で、MVA に E5 が存在しても IFN 産生を完全にブロックすることはできず、これは機能的な WR200/B19R (IFNAR)、B2R、またはその他の潜在的な阻害剤の欠如に起因すると考えられます 15。これまでの研究では、B2、C4、C16、F17、N2、C619、44、45、46、47、48、49などの複数のワクシニアウイルスタンパク質がDNA駆動型I型IFN誘導を標的とすることが実証されています。具体的には、C4 と C16 は、線維芽細胞の IRF3 活性化に役割を果たす別の DNA センサーである DNA-PK を標的とし 44、45、50 、MVA15 では両方とも変異または欠失しています。

E5 は、ワクシニア感染細胞のウィロソームに関連する 3 つの主要な初期ウイルスタンパク質の 1 つとして質量分析法によって初めて同定されましたが 33、E5 の機能は依然として解明されていませんでした。 E5 は、化学架橋後の質量分析によって高度に精製されたビリオンでも検出され、RNA ポリメラーゼサブユニット RAP94、RP147、および NTP151 を含むいくつかの相互作用パートナーが同定されました。ここでは、感染細胞の核と細胞質の両方に E5 が存在することを示します。 MVAΔE5R-E5R95K-Flag感染細胞では、E5R95Kは細胞質にのみ局在しますが、IFN阻害を媒介するには十分です。 R95K 変異は、E5 の推定核局在化シグナル、92KFKRMIR98 内にあります。

我々は、E5 がプロテアソーム依存性経路を介して cGAS 分解を媒介することを示します。結果に基づいて次の作業モデルを提案します (図 5g)。ワクシニアウイルスはマクロピノサイトーシスを介して宿主細胞に侵入します52。ウイルスが侵入すると、ウイルス DNA はサイトゾル DNA センサー cGAS によって検出され、その活性化により cGAMP 産生とその後の STING 刺激が引き起こされます。しかし、主に初期ウイルスタンパク質として入ってくるビリオンによって合成されるワクシニア E5 の存在下では、cGAS は E5 との相互作用を通じてユビキチン化およびプロテアソーム依存性分解の標的となります。これにより、cGAMP 産生と Ifnb1 遺伝子発現が減少します。 E5 が ISG などの宿主タンパク質の標的になる可能性があります。大腸菌を用いた細菌発現系、Sf9を用いた昆虫細胞発現系、哺乳動物細胞発現など、さまざまなタンパク質発現系で多くの試みがあったにもかかわらず、組換えE5タンパク質を生成できなかったため、cGASとE5の間の直接相互作用を示すことができませんでした。チャイニーズハムスターの卵巣を用いたシステム。いくつかの実験系で免疫共沈降を介した E5 と cGAS の相互作用を示すことができましたが、この相互作用はベンゾナーゼ処理によって破壊されませんでしたが、この研究では cGAS と E5 が直接相互作用していると結論付けることはできません。さらに、新たに発現した E5 の一部が核に移行することも観察されました。核 cGAS はヌクレオソームによって阻害されることが報告されています 53,54。核 E5 の正確な機能についてはさらなる調査が必要です。

我々は以前、ウイルス複製はBMDCにおけるMVAセンシングにとって重要ではないことを報告した43。しかし、この研究では、MVAΔE5R によって誘導される Ifnb1 遺伝子発現は、ウイルス DNA 複製阻害剤である PAA およびアフィジコリンの存在下で部分的に減少しました。この結果は、MVAΔE5R 感染環境ではウイルスソーム子孫 DNA が cGAS によって検出されることを示唆しています。私たちは、MVA 感染中に E5 が存在すると、ウイルスソーム子孫 DNA が cGAS センシングから保護されるのではないかと推測しています。

ユビキチン化、リン酸化、アセチル化、SUMO化、ISG化、グルタミル化、ネディ化、カスパーゼ媒介切断など、cGASのさまざまな翻訳後修飾が報告されています55,56。例えば、RING ドメイン E3 ユビキチンリガーゼである RNF185 は、ヒト単純ウイルス 1 (HSV-1) 感染中に cGAS と相互作用し、cGAS の酵素活性にとって重要な、cGAS の K27 結合ポリユビキチン化を刺激することが示されています 57。 IFN 誘導性 E3 ユビキチンリガーゼである TRIM56 は、cGAS と相互作用してモノユビキチン化と cGAMP 生成を促進します 58。さらに、IFN 誘導性タンパク質である TRIM14 は USP14 を動員して cGAS の K48 結合ポリユビキチン鎖を切断し、それによってオートファジーを介した cGAS 分解を阻害します 59。 cGAS の K48 結合ポリユビキチン化に関与するユビキチン E3 リガーゼは依然として解明されていません 59。今回我々は、MVA感染がcGASのモノユビキチン化およびポリユビキチン化を誘導し、プロテアソーム依存的にその分解を促進することを示す。 E5 は、cGAS との相互作用を介したこのプロセスにとって重要です。しかし、E5がウイルスまたは細胞のE3ユビキチンリガーゼをどのように動員してcGASのユビキチン化を触媒するかについての正確な詳細はまだ解明されていない。

cGAS の主要な阻害剤としての E5 の発見は、ワクチンベクターとしての MVA の改善に関する重要な洞察を提供します。今回我々は、BMDCのMVAΔE5R-OVA感染が高レベルのIFN-β産生とDC成熟を誘導し、MVAΔE5Rによって誘導されるcGAS依存性のトランスクリプトーム変化と一致することを示す。 MVAΔE5R-OVA によるワクチン接種は、MVA-OVA と比較して、より高いレベルの OVA 特異的 CD8+ および Th1 CD4+ T 細胞を誘導します。最近の研究では、SARS-CoV-2 スパイクタンパク質を発現する MVA ベースのワクチンベクターが強力な抗スパイク T 細胞および B 細胞免疫反応を誘導し、マウス、ハムスター、マカクを SARS-CoV-2 感染および肺の免疫病理から保護することが示されています60。 61、62、63、64。 MVAΔE5R ベースのワクチンベクターが SARS-CoV-2 などの感染性病原体に対するワクチンの有効性を向上させるかどうかについての今後の研究は正当である。

この研究で同定されたすべてのワクシニアコードcGAS阻害剤候補、E5、K7、C11、WR199/B18、WR200/B19、および以前に報告されたB2（ポキシン）の中で、BMDCのVACVΔE5R感染のみが有意なレベルのタイプの感染を誘発した。 I IFN (図 1d)。 DCにおけるcGAS/STING経路の活性化がウイルス誘発腫瘍溶解性ウイルス療法にとって重要であることを考えると65、腫瘍溶解性ワクシニアからE5Rおよびおそらくこの経路の他の阻害剤を削除することにより、その安全性と治療可能性が向上すると考えられる。

私たちの研究は、関連するすべての倫理規制に準拠しています。私たちはすべての手順を国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関するガイドの推奨事項に厳密に従って実施し、そのプロトコール (#19-01-002) は記念スローンケタリングがんセンター (MSKCC) によって承認されました。 ) 施設内動物管理使用委員会 (IACUC)。すべてのマウスは、MSKCC 特異的病原体を含まない動物施設で、温度 21.1 ～ 22.2 °C (70 ～ 72 °F)、湿度 30 ～ 70%、および 12:12 時間の明暗サイクルで飼育されました。（点灯時間は午前6時から午後6時まで）。マウスは実験終了時に二酸化炭素窒息により安楽死させられ、物理的な二次保証法として頚椎脱臼が行われた。

生後 6 ～ 8 週の C57BL/6J マウスを Jackson Laboratory から購入し、骨髄由来樹状細胞 (BMDC) の調製および鼻腔内感染実験に使用しました。 cGas-/- マウスは Jackson Laboratory から購入しました。 Stinggt/gt マウスは、Russell Vance (カリフォルニア大学バークレー校) の研究室で作製されました 66。 Mda5-/- マウスは、マルココロンナの研究室 (ワシントン大学) で生成されました 67。 Irf3-/- マウスは、Ruslan Medzhitov (Yale University) によって提供された。 Irf7-/- マウスは、アキラ静夫 (大阪大学) によって作製されました。すべてのトランスジェニックマウスは C57BJ/6J バックグラウンドです。

ワクシニアウイルスの WR 株 (VACV) (ATCC VR-1354) を増殖させ、ウイルス力価を BSC40 (アフリカミドリザル腎臓細胞) 単層で 37 °C で測定しました。 MVA は Gerd Sutter (ミュンヘン大学) のご厚意により提供され、BHK-21 (ベビーハムスター腎細胞、ATCC CCL-10) 細胞内で増殖されました。 MVA-OVA は、Ingo Drexler 博士 (デュッセルドルフハインリヒハイネ大学) からの親切な贈り物でした。 VACVΔE3L は、BL Jacobs (アリゾナ州立大学) のご厚意により提供されました。 VACVΔC11R ウイルスは、Bernard Moss (国立衛生研究所) のご好意により提供されました 68。すべてのウイルスは 36% ショ糖クッションを通して精製されました。 Heat-iMVA または Heat-iMVAΔE5R は、精製 MVA または MVAΔE5R ウイルスを 55 °C で 1 時間インキュベートすることによって生成されました。組換え VACVΔE5R ウイルスを生成するために、BSC40 細胞を MOI 0.2 で WT ワクシニアウイルス (WR) に感染させました。 1 ～ 2 時間後、リポフェクタミン 2000 (Invitrogen) を含む pE5R-mCherry プラスミドで細胞をトランスフェクトしました。プラスミド DNA とワクシニアウイルスゲノム間の相同組換えにより、ウイルスゲノムから E5R 遺伝子が欠失し、ワクシニア合成初期および後期プロモーター (pSE/L) の制御下で mCherry が挿入されました。 2日後に細胞を回収し、3サイクルの凍結融解を行った。プラーク精製は、顕微鏡下で観察される mCherry 蛍光に基づいて実行されました。 4～5ラウンド後、純粋な組換えVACVΔE5R-mCherryウイルスが得られ、E5R欠失の検証はPCR分析およびDNA配列決定によって確認された。 mcherryを発現するVACVΔWR199、VACVΔK7R、VACVΔC7L、VACVΔB2R、およびGFPを発現するVACVΔWR200を含む他の様々な欠失変異体を、上記と同様の手順に従って生成した。 VACV-E5R-FL、VACV-E5RΔ59N、VACV-E5RΔ106N、VACV-E5RΔ224N、VACV-E5RΔ117C、およびVACV-E5RΔ235Cは、全長または短縮型E5RをE5R遺伝子座に挿入することによって生成されました。 VACVΔE5Rの。 mCherryを発現するMVAΔE5RおよびMVAΔE5R-OVAは、上記と同様の手順に従って、BHK21細胞のMVAまたはMVA-OVAゲノムのE5R遺伝子に隣接するE4LおよびE6R遺伝子座での相同組換えによって生成されました。 MVAΔE5R-E5-Flag は、E5R-Flag 配列を MVAΔE5R の TK 遺伝子座に挿入することによって生成されました。 MVAΔE5R-E5R95K-Flagは、薬物選択を使用してMVAΔE5RのTK遺伝子座にE5R-Flag配列を挿入することによって生成されました。組換えウイルスは、MPA、キサンチン、ヒポキサンチンを含む gpt 選択培地の存在下で濃縮され、プラークは少なくとも 4 ラウンド精製されました。選択プロセス中に自然突然変異が発生し、その結果 MVAΔE5R-E5R95K-Flag が生成され、PCR および DNA シークエンシングによって検証されました。組換えワクシニアウイルスは、ゲノムウイルスDNAのPCRによって検証されました（補足図7）。

6〜8週齢の雌C57BL/6Jマウス（各群5〜10匹）を麻酔し、指定された位置でE5R全長復帰変異体およびさまざまなE5R切断変異体を発現するWT VACV、VACVΔE5RまたはVACVΔE5を鼻腔内感染させた。用量は 20 µl PBS に溶解します。マウスを毎日監視し、体重を測定した。最初の体重の 30% 以上減少した個体は安楽死させられました。カプラン・マイヤー生存曲線を決定した。 1 mL の冷 PBS を気管内に注入した後、気管支肺胞洗浄液 (BALF) を採取しました。さまざまな臓器内のウイルス力価を測定するために、肺、肝臓、脾臓を採取し、1 mL の PBS を含むチューブに入れ、Miltenyi GentleMACS Dissociator を使用してホモジナイズしました。細胞懸濁液は凍結融解サイクルを 3 回繰り返し、BSC40 細胞で滴定する前に超音波処理しました。血液を 1.5 mL エッペンドルフチューブに採取し、遠心分離後血清を保管しました。ウイルス力価は、組織グラム当たりのプラーク数（pfu）（pfu/g）を計算することによって決定した。

BSC40をMOI 0.05でWT VACVまたはVACVΔE5Rに感染させた。次いで、細胞を培地中にこすり落とし、指定された時間に収集した。凍結融解とその後の超音波処理を 3 サイクル行った後、収集したサンプル中のウイルス力価を BSC40 細胞のプラークアッセイによって測定しました。

6〜8週齢の雌C57BL/6Jマウスに、MVA-OVAまたはMVAΔE5R-OVAを2×107pfuの用量でSSまたはID注射によりワクチン接種した。 1 週間後、脾臓と流入リンパ節 (dLN) を収集し、Miltenyi GentleMACS™ Dissociator を使用して処理しました。脾細胞を OVA257-264 (SIINFEKL) ペプチド (5 μg/mL) で刺激しました。 1 時間の刺激後、GolgiPlug (BD Biosciences) (1:1000 希釈) を添加し、12 時間インキュベートしました。次いで、フローサイトメトリー分析のためにそれぞれの抗体で染色する前に、細胞をBD Cytofix/Cytoperm™ キットで処理しました。このアッセイに使用した抗体は次のとおりです: BioLegend: CD3e (145-2C11)、CD4 (GK1.5)、CD8 (53-5.8)、IFN-γ (XMG1.2)。

dLN をコラゲナーゼ D (2.5 mg/mL) および DNase (50 μg/mL) で 37 °C で 25 分間消化した後、70 μ m のセルストレーナーで濾過しました。四量体染色の場合、細胞を四量体とともに 37 °C で 30 分間インキュベートしました。 Alexa Fluor 647 H-2K(b) ova 257-264 SIINFEKL テトラマーおよび PE IA(b) Ova 329-337 AAHAEINEA テトラマーは、NIH Tetramer Core Facility から合成されました。細胞はBD LSRFortessaで分析されました。

BSC40、HEK293T、および MEF を、10% ウシ胎児血清 (FBS)、2 mM l-グルタミン、100 U/mL ペニシリンおよび 100 μg を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (Corning、カタログ番号 10-014-CV) で培養しました。 /mLストレプトマイシン。 BHK-21は、10％FBS、100U/mLペニシリンおよび100μg/mLストレプトマイシンを含むEagle's Minimal Essential Medium（Eagle's MEM、Life Technologies、カタログ番号11095-080）で培養しました。 GM-CSF-BMDC の生成では、骨髄細胞 (各 15 cm 細胞培養皿に 500 万個の細胞) を GM-CSF (20 ng/mL、 BioLegend、Cat# 576304) 前述のように 9 ～ 12 日間 43。骨髄由来マクロファージ (BMM) の生成では、骨髄細胞を M-CSF (10 ng/mL、PeproTech、カタログ番号 315-02) の存在下、10% FBS を添加した RPMI-1640 培地で培養しました。 7～9日。

皮膚真皮線維芽細胞の生成: マウスの表皮シートを前述のように除去しました69。簡単に説明すると、皮膚を冷 Ca2+ および Mg2+ を含まない PBS で洗浄し、1 U ディスパーゼ/mL を含む消化緩衝液中で 37 °C で 1 時間インキュベートしました。表皮シートを機械的に除去し、残りの真皮を Ca2+ および Mg2+ を含まない PBS で 5 回洗浄し、2 mg/mL コラゲナーゼ A (Roche)、100 μg/mL の DNase I (Sigma、d4527) およびCa2+ および Mg2+ を含まない PBS 中の 1% BSA、37 °C、1 ～ 2 時間。得られた懸濁液を、１００、７０、および４０ｍｍのナイロンメッシュ（ＶＷＲ）で順次濾過し、緩衝液（１％ＢＳＡおよび２ｍＭのＥＤＴＡを含むＣａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞は、10% FBS を補充した RPMI-1640 培地で培養しました。 2 ～ 3 日間の培養後に接着細胞のみを使用しました。

BALF 中の IFN-β レベルは、マウス IFN β ProQuantum Immunoassay キット (ThermoFisher) を使用して測定しました。培養BMDCの上清中のIFN-αおよびIFN-βレベルをELISA(PBL Biomedical Laboratories)によって測定した。

WT または cGAS-/- マウスからの GM-CSF-BMDC に、MVA-OVA または MVAΔE5R-OVA を MOI 10 で 16 時間感染させました。細胞をMACS緩衝液(Miltenyi Biotec)で洗浄し、CD40(3/23、Biolegend)およびCD86(GL-1、Biolegend)に対する抗体で染色した。 FACS分析は、LSRFortessaTM Cell Analyzer (BD Biosciences)を使用して実行されました。データはFACSDiva 8.0で収集され、FlowJoソフトウェア（バージョン10.5.3）で分析されました。

培養細胞を Lab-TekTM II チャンバースライド (ThermoFisher) にプレーティングし、4% (w/v) パラホルムアルデヒドで室温 (RT) で 10 分間固定し、PBS 中の 0.5% (v/v) Triton X-100 で透過処理しました。 5 分間ブロックし、5% ヤギ血清 (Sigma)、3% ウシ血清アルブミン (Fisher)、および 0.1% Triton X-100 中で室温で 1 時間ブロックしました。一次抗体を、示された希釈率で 4 °C で一晩インキュベートしました: マウス抗 Flag (1:1000、Sigma) および抗 cGAS (1:1000、Abcam)。 PBSで3回洗浄した後、スライドを、ヤギ抗マウスAlexa Fluor-647 (1:1000、Invitrogen)およびヤギ抗ウサギAlexa Fluor-488 (1:1000、Invitrogen)を含む示された二次抗体とともに室温で60分間インキュベートした。分。 PBSで3回洗浄した後、スライドをProLong Gold Antifade Mountant (ThermoFisher)にマウントしました。画像は、共焦点顕微鏡 (Leica TCS SP8 または Zeiss LSM880) を使用して取得しました。

MEF のビリソームの微速度撮影イメージングでは、細胞を Lab-TekTM II チャンバースライド (ThermoFisher) に播種し、MOI 10 で MVAΔE5R に感染させ、蛍光発生 SiR-DNA (Cytoskeleton) で染色しました。細胞は、5% CO2 を補充して 37 °C でインキュベートしました。画像は ZEISS Axio Observer Z1 を使用して取得されました。すべての画像を Image J ソフトウェアでさらに処理しました。

IFN-β レポータープラスミド (pIFN-β-luc)70 は Michaela Gack (シカゴ大学) から提供されました。 pRL-TKはPromegaから購入しました。ヒト STING 発現プラスミドは Tom Maniatis (コロンビア大学) によって提供されました。マウス STING (mSTING) 配列を PCR によって増幅し、pcDNA3.2-DEST プラスミドにクローン化しました。ヒト cGAS (hcGAS) およびマウス cGAS (mcGAS) プラスミドは Invivogen から購入しました。 V5-cGAS は PCR によって増幅され、pcDNA3.2-DEST プラスミドにクローン化されました。 pRK-HA-ユビキチン-WT、pRK-HA-ユビキチン-K48、およびpBabe 12S E1AはAddgeneから購入しました。 80個の選択されたVACV遺伝子をVACV WRゲノムからPCRによって増幅し、Gatewayクローニング法(Invitrogen)を使用してpcDNA3.2-DESTにサブクローニングした。 Flagタグ付きE1AおよびFlagタグ付きVACV遺伝子をPCRによって増幅し、Gatewayクローニング法(Invitrogen)を使用してpcDNA3.2-DESTにサブクローニングしました。 VACV E5R (aa: 55-341) を VACV WR ゲノムから PCR によって増幅し、pcDNA3.1 および pQCXIP にサブクローニングしました。

HEK293T 細胞を 6 ウェルプレートに継代しました。翌日、細胞に 3 つのプラスミド - VSVG、gag/pol、pQCXIP-E5R またはリポフェクタミン 2000 を含む pQCXIP をトランスフェクトしました。 2 日後、細胞上清を収集し、0.45 μm フィルターで濾過し、-80 °C で保存しました。

ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを製造業者 (Promega) の指示に従って使用して測定しました。 cGAS/STING 経路のワクシニア阻害剤をスクリーニングするには、cGAS (50 ng) および STING (10 ng) 発現プラスミド、pIFN-β-luc (50 ng)、pRL-TK (10 ng)、および選択されたワクシニア遺伝子発現プラスミドまたはアデノウイルス E1A 発現プラスミド (200 ng) を HEK293T 細胞にトランスフェクトしました。トランスフェクションの 24 時間後、細胞を収集し、溶解しました。 STING 経路のワクシニア阻害剤の効果を評価するには、STING (50 ng) 発現プラスミド、pIFN-β-luc (50 ng)、pRL-TK (10 ng)、および選択されたワクシニア遺伝子発現、構築物、またはアデノウイルス E1A 発現プラスミド (200 ng) を HEK293T 細胞にトランスフェクトしました。相対ルシフェラーゼ活性は、IFNBプロモーター下のホタルルシフェラーゼ活性を、対照プラスミドpRL-TKからのウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化することにより、任意の単位として表した。

細胞を、１×Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を補充したＲＩＰＡ溶解緩衝液中で溶解した。細胞質および核タンパク質を抽出するために、細胞を NE-PER 核および細胞質抽出キット (ThermoFisher、78833) で処理しました。タンパク質サンプルを SDS-PAGE で分離した後、ニトロセルロース膜に転写し、cGAS (CST、31659)、STING (CST、13647)、FLAG (Sigma、F3165)、HA (Sigma、H3663)、V5 に特異的な一次抗体とインキュベートしました。 (ThermoFisher、R960-25)、mCherry (ThermoFisher、M11217)、β-アクチン (Sigma、A2228)、ラミン B1 (Sigma、ZRB1143)、および GAPDH (CST、2118) を使用しました。 C7 抗体は私たちの研究室で生成され、以前に説明されました24。 E3 抗体は、Stuart N. Isaacs 博士 (ペンシルバニア大学) のご厚意により提供されました 71。 HRP 結合抗ウサギ、マウス、またはラット IgG 抗体を二次抗体として使用しました (CST、7074、7076、または 7077)。検出は、SuperSignalTM Substrates (Thermo Fisher、34577 または 34095) を使用して実行されました。

ワクシニアウイルス感染中のユビキチン化cGASタンパク質を検出するために、MG132（25μg/mL）の存在下でBMDCをMOI 10でMVAに6時間感染させた。ユビキチン化タンパク質は、前述のように Halo-4x UBAUBQLN1 を使用して精製しました 40。簡単に説明すると、全細胞抽出物 (1 mg) を 100 mM クロロアセトアミドを含む溶解バッファーで溶解し、30 μL の Halo-4x UBAUBQLN1 ビーズ (パック容量) とともに 4 °C で 16 時間インキュベートしました。 1 M NaClを含む溶解バッファーで4回洗浄し、10 mM Tris (pH 8.0)で最後に1回洗浄した後、SDS-PAGEによる分析前にサンプルバッファーを使用してタンパク質をHalo-4xUBAUBQLN1から遊離させました。 cGAS と E5R の共トランスフェクションでは、10 cm プレート内の HEK293T 細胞を V5-cGAS と E5R-Flag または pcDNA3.1 でトランスフェクトしました。 24 時間後、細胞を MG132 (25 μg/mL) で 6 時間処理した後、溶解バッファーで溶解しました。

cGAS ユビキチン化アッセイでは、10 cm プレート内の HEK293T 細胞に V5-cGAS を HA-Ub-WT または HA-Ub-K48 とともにトランスフェクトしました。 24時間後、細胞をMG132（25μg/mL）の存在下、MOI 10でMVAまたはMVAΔE5Rで6時間感染させ、氷上のRIPA溶解緩衝液（ThermoFisher、89901）中で30分間溶解した。抗 V5 抗体 (ThermoFisher、R960-25) を最終濃度 1 μg/mL になるように細胞溶解物に添加し、ローテーター上で 4 °C で一晩インキュベートしました。翌日、プロテイン G 磁気ビーズ (Bio-Rad、161-4023) を加え、4 °C で 2 時間インキュベートしました。ビーズをRIPA緩衝液で5回洗浄した。最後に、SDS-PAGE ゲルにロードする前に、ビーズに結合したタンパク質を 98 °C で 5 分間加熱することにより SDS バッファー中で変性させました。

cGAS と E5 の相互作用アッセイでは、10 cm プレート内の HEK293T 細胞に V5-cGAS を E5R-Flag または pcDNA3.1 とともにトランスフェクトしました。 2日後、細胞を氷上のPierce IP溶解緩衝液中で30分間溶解させた。細胞溶解物を、プロテイン G-アガロース (ThermoFisher、20399) と混合する前に、250 U/mL ベンゾナーゼ (Sigma、E8263) の存在下または非存在下で 4 °C で 30 分間処理しました。 BMDC では、細胞を MVAΔE5R-E5R-Flag で MOI 10 で 6 時間感染させました。細胞を上記のように溶解した。 cGAS 抗体 (Abcam、ab252416) を最終濃度 1 μg/ml になるように細胞溶解物に添加し、ローテーター上で 4 °C で一晩インキュベートしました。翌日、プロテイン G アガロースビーズを加え、4 °C で 2 時間インキュベートしました。ビーズをIP溶解緩衝液で5回洗浄した。最後に、SDS バッファー中のタンパク質を 98 °C で 5 分間加熱して変性させた後、SDS-PAGE にロードしました。

TRIzol試薬(Invitrogen)またはRNeasy Plus Miniキット(Qiagen)を使用して、全細胞溶解物から全RNAを抽出しました。 Verso cDNA 合成キット (Thermo Fisher) および SYBRTM Green Master Mix (Thermo Fisher) を使用して、RNA を逆転写し、PCR によって増幅しました。細胞の RNA は GAPDH レベルに対して正規化されました。 GAPDH レベルは、ウイルス感染下の BMDC で安定していました 43。 ΔΔCt 法は遺伝子発現の測定に使用され、qPCR アッセイの効率は 90% ～ 110% でした 72。すべてのアッセイは ABI 7500 システムで実行され、ABI 7500 SDS ソフトウェア v.1.3 (Applied Biosystems) で分析され、MIQE73 に従って分析されました。データ分布は Shapiro-Wilk 検定で評価されました。プライマー配列を表 S1 に示します。

cGAMP は、以前に報告されているように LC-MS によって測定されました 74。簡単に説明すると、細胞ペレットに 80 fmol の内部標準 (15N10-cGAMP、社内生成) を補充し、その後 80% メタノールと 2% 酢酸で抽出し、2% 酢酸で 2 回抽出して代謝産物抽出物を得ました。 cGAMP は、HyperSep アミノプロピル SPE カラム (Thermo Scientific) で結合抽出物から濃縮されました。 2%酢酸で2回、80%メタノールで1回洗浄した後、サンプルを80%メタノール中の4%水酸化アンモニウムで溶離しました。真空乾燥した溶離液を水に溶解し、TSQ Quantiva Triple Quadruple 質量分析計 (Thermo Scientific) と組み合わせた Dionex U3000 HPLC で分析しました。クロマトグラフィーでは、0.1 mm ID × 70 mm L シリカキャピラリーに充填された固定相として LUNA NH2 樹脂 (5 μm、Phenomenex) を使用しました。移動相はアセトニトリル (A)、20 mM 重炭酸アンモニウム、および 20 mM 水酸化アンモニウム水溶液 (B) です。流量は 800 nL/分 (0 ～ 4 分)、300 nL/分 (4 ～ 19 分)、および 600 nL/分 (19 ～ 27 分)、勾配は 20% B (0 ～ 3 分) です。、50% B (4 分)、80% B (14 ～ 18 分)、および 20% B (19 ～ 27 分)。 cGAMP と標準は、次の遷移を伴うポジティブモードでの多重反応モニタリングによって分析されました。 15N10-cGAMP 標準の場合は 685-136、685-157、685-480、および 685-529。内因性 cGAMP レベルは、cGAMP と標準の比率に 80 fmol (各サンプルに添加された標準の量) を乗じることによって計算されました。

WT または cGAS-/- マウスの GM-CSF 培養 BMDC (1 × 106) に、感染多重度 (MOI) 10 で MVA または MVAΔE5R を感染させました。感染後 16 時間で細胞を収集しました。 RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen) を製造業者のプロトコールに従って使用し、DNase I 処理を含め、指定の時点で収集した細胞から全 RNA を抽出しました。総RNAの完全性は、2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)を使用して分析されました。メッセンジャー RNA は、TruSeq Stranded mRNA サンプルライブラリー調製キット (Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ) を製造業者の指示に従って使用して調製しました。正規化された最終 cDNA ライブラリーをプールし、Illumina NovaSeq6000 シーケンサーでペアエンド 50 サイクルで配列決定しました。 BCL 形式の生のシーケンスリードは、FASTQ 変換および逆多重化のために bcl2fastq 2.19 (Illumina) を通じて処理されました。 Cutadapt (バージョン 1.18) でアダプターをトリミングした後、STAR (バージョン 2.5.2) によって RNA リードをアライメントして GRCh38 ヒト参照ゲノムにマッピングし、Cufflinks (バージョン 2.1.1) によってトランスクリプトーム再構築を実行しました。転写物の存在量は、100 万マッピングリードあたりのエクソンモデル (FPKM) のキロベースあたりのフラグメントのカフリンクを使用して測定されました。遺伝子発現プロファイルは、DESeq2 パッケージを使用して、発現差、クラスター、主成分分析のために構築されました。 Broad Institute の GSEA ソフトウェアを使用して、差次的に発現される遺伝子の機能を特定しました。遺伝子は発現差解析から得られた log2 FC 値によってランク付けされ、事前にランク付けされたバージョンのツールを使用して、著しく濃縮された生物学的経路を特定しました。大幅に濃縮された生物学的経路のヒートマップは、R パッケージ pheatmap (https://www.rdocumentation.org/packages/pheatmap/versions/1.0.12/topics/pheatmap) を使用して生成されました。

火山プロットは、R パッケージ EnhancedVolcano (https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/EnhancedVolcano.html) を使用して生成されました。

このプロジェクトの RNA-Seq データは、NCBI の Gene Expression Omnibus、受託番号 GSE185431 に寄託されています。

研究では、対応のない両側スチューデント t 検定を 2 つのグループの比較に使用しました。生存データは、ログランク (Mantel-Cox) 検定によって分析されました。有意であるとみなされる p 値は、以下のように図に示されています。 *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001。研究に含まれる動物の数は、各図の凡例で説明されています。

すべてのユニークな資料は、リクエストに応じて対応する著者からすぐに入手できます。 VACVタンパク質C7を認識する抗体の入手可能性は限られています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

RNAseq データは、受託番号 GSE185431 で Gene Expression Omnibus (GEO) に寄託されています。この研究結果を裏付けるその他のデータはすべて、論文およびその補足情報ファイル内で入手できます。ソースデータはこの文書で提供されます。

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スローンケタリング研究所のフローサイトメトリーコア施設と分子細胞学コア施設に感謝します。博士たちに感謝します。 Charles Rice と Stewart Shuman に有益な議論をしていただきました。この研究は、NIH 助成金 K-08 AI073736 (LD)、R56AI095692 (LD)、R03 AR068118 (LD)、R35 GM132111 (HF)、および MSK 技術開発基金 (LD)、IMVAQ Therapeutics (LD) からのスポンサー研究契約によって支援されました。、およびテキサス州癌予防研究所、RP180725 (ZJC)。 ZJC は、ハワードヒューズ医学研究所の研究者です。この研究は、NIH/NCI がんセンター支援助成金 P30 CA008748 からも一部資金提供を受けました。

クリスチャン・ツィールハット

現在の住所: 英国癌研究所、ロンドン、SW3 6JB

メモリアル・スローン・ケタリングがんセンター医学部皮膚科サービス、ニューヨーク、ニューヨーク、10065、米国

ニン・ヤン、イー・ワン、ペイホン・ダイ、リャン・デン

分子生物学部、テキサス大学サウスウェスタン医療センター、ダラス、テキサス州、75390、米国

トゥオ・リー＆ジージャン・チェン

染色体および細胞生物学研究所、ロックフェラー大学、ニューヨーク、ニューヨーク、10065、米国

クリスチャン・ツィールハット & 船曳宏典

ゲノムリソースコア施設、ワイルコーネル医科大学、ニューヨーク、ニューヨーク、10065、米国

エイドリアン・タン、トゥオ・チャン、ジェニー・チャオイン・シャン

細胞生物学プログラム、スローンケタリング研究所、記念スローンケタリングがんセンター、ニューヨーク、ニューヨーク、10065、米国

アルバン・オルデュロー

人間の腫瘍学および病因プログラム、メモリアルスローンケタリングがんセンター、ニューヨーク、ニューヨーク、10065、米国

リャン・デン

ワイルコーネル医科大学、ニューヨーク、ニューヨーク州、10065、米国

リャン・デン

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著者の貢献: NY と LD は、プロジェクトの構想、実験の設計と実行、データの分析と解釈、論文の執筆など、この研究のあらゆる側面に関与しました。ニューヨーク大学は、細胞質 DNA 感知経路のワクシニア阻害剤のスクリーニングを設計し、ほとんどの実験を実施しました。 YW は、ワクシニア阻害剤のスクリーニングと検証においてニューヨーク州を支援しました。 YW と LD は RNA-seq 実験を実施しました。 YW と LD は、さまざまな VACV E5 欠失ウイルスを生成し、病因研究を実施しました。 PD および TL は、ワクシニアおよび MVA に感染した BMDC における cGAMP 測定に関与します。 AT、TZ、および JZX は RNA-seq データを分析し、原稿の作成を支援しました。 CZ、HF、AO、ZJC は、実験計画、データ解釈、原稿の準備を支援しました。 LDはプロジェクトの全体的な監督を行いました。

寧陽または梁登に相当。

メモリアル・スローン・ケタリングがんセンターは、サイトゾルDNA感知経路のワクシニアウイルス阻害剤の発見と、MVAとワクシニアを腫瘍溶解剤およびワクチンベクターとして改善するためのその使用について特許出願を行った。この特許はIMVAQ Therapeuticsにライセンスされています。 LD と NY は IMVAQ Therapeutics の共同創設者です。残りの著者は競合する利益を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた François Meurens、Luis Sigal、およびその他の匿名の査読者に感謝します。

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転載と許可

Yang, N.、Wang, Y.、Dai, P. 他ワクシニア E5 は、DNA センサー cGAS の主要な阻害剤です。 Nat Commun 14、2898 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41467-023-38514-5

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受信日: 2022 年 6 月 2 日

受理日: 2023 年 5 月 5 日

公開日: 2023 年 5 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38514-5

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