SnRK2.3 | 北京東方日出有限公司

Nature Plants (2023)この記事を引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

可溶性糖は果実の品質の中核成分であり、糖の蓄積の程度は液胞体に局在する糖輸送体によって主に決定されます。我々は以前、液胞における糖の蓄積を協調的に調節する2クラスの液胞体糖輸送体、MdERDL6とMdTST1/2を示した。ただし、この調整の根底にあるメカニズムはまだ不明です。今回我々は、2つの転写因子MdAREB1.1/1.2がリンゴのプロモーターに結合することでMdTST1/2の発現を調節していることを発見した。 MdERDL6-1過剰発現植物におけるMdAREB1.1/1.2発現の増強は、MdTST1/2発現および糖濃度の増加をもたらした。さらなる研究により、MdERDL6-1の発現によってその発現が調節されるMdSnRK2.3がMdAREB1.1/1.2と相互作用してリン酸化し、それによってMdAREB1.1/1.2を介したMdTST1/2の転写活性化が促進されることが確立された。最後に、オルソロガスな SlAREB1.2 と SlSnRK2.3 は、リンゴの対応物と同様にトマト果実でも同様の機能を示しました。まとめると、我々の発見は、果糖の蓄積に対してSnRK2.3-AREB1-TST1/2によって発揮される液胞細胞の糖輸送の調節機構についての洞察を提供する。

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この研究の結果を裏付けるすべてのデータは、本文または補足情報で入手できます。この研究に関連する追加データは、要求に応じて責任著者から入手できます。この研究で使用されたすべての生物学的材料は、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。ソースデータはこのペーパーに付属しています。

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GC-MS 分析に関して専門的な技術支援を提供していただいた J. Zhang と J. Zhao (中国、楊陵の西北農工大学園芸科学研究センター) に感謝します。 H. Zhao および F. Yuan (中国、陽陵のノースウェスト A&F 大学、乾燥地域作物ストレス生物学の国家主要研究所)、および Y. Yuan および R. Chen (中国、陽陵のノースウェスト A&F 大学園芸科学研究センター)共焦点顕微鏡の実験支援を提供します。この研究は、ML への中国国家自然科学財団プログラム (31872043)、ML への陝西省科学技術イノベーションチームプロジェクト (2022TD-18)、Y.-LR へのオーストラリア研究評議会 (DP180103834) によって支援されました。および中国農業研究システム指定基金 (CARS-27) から FM へ

これらの著者は同様に貢献しました: Lingcheng Zhu、Yanzhen Li。

乾燥地域における作物ストレス生物学の州重点研究所/陝西省リンゴ重点研究所、西北農工大学園芸学部、咸陽、中国

Lingcheng Zhu、Yanzhen Li、Chengcheng Wang、Zhiqi Wang、Wenjing Cao、Jing Su、Yunjing Peng、Baiyun Li、Baiquan Ma、Fengwang Ma、Yong-Ling Ruan、Mingjun Li

西北農工大学生命科学部、咸陽、中国

朱玲成

オーストラリア国立大学生物学研究部植物科学部門、オーストラリア首都特別地域、キャンベラ

ルアン・ヨンリン

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LZ、ML、FM、Y.-LR がこの研究を企画しました。 LZ、YL、CW、ZW、JS、YP、BL、WC、BM が実験を実施しました。 LZ、JS、YL、ML、Y.-LR がデータを分析しました。 LZ、ML、Y.-LR がこの論文を執筆しました。 ML と FM が研究を監督しました。著者全員が最終論文を読んで承認しました。

Fengwang Ma、Yong-Ling Ruan、Mingjun Li との通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Plants は、この研究の査読への貢献について、Jintao Cheng、Li-Qing Chen、H. Ekkehard Neuhaus に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、b、MdERDL6-1 を過剰発現したリンゴの葉 (a) およびトマト果実 (b) におけるコンパートメント特異的マーカーの相対分布。 NAF手順を使用して組織を分画し、5つの分画中のマーカー酵素の活性を測定しました。データは各画分における活性の割合として表されます。 AGPase、UGPase、ACP をそれぞれ色素体、細胞質、液胞のマーカーとして使用しました。 c、d、MdERDL6-1を過剰発現したリンゴの葉（c）およびトマト果実（d）の色素体、サイトゾル、および液胞画分におけるGlc、Fru、およびSucの細胞内濃度。データがありません。バーは平均値 ± SD (n = 3 の独立した生物学的複製) を表します。 (c、d) のアスタリスクは、Student の t 検定 (両側) によって評価された有意差を示します。 ***P < 0.001、**P < 0.01、*P < 0.05、ns、有意ではありません。

ソースデータ

a、MdERDL6-1 トランスジェニックリンゴの RNA 配列において差次的に発現された転写因子。閾値は、RPKM > 1、倍率変化 > 1.5 として設定されました。 b、c、リンゴ果実におけるATAC-seqに基づいて、予測される活性転写因子がMdTST1 (b) およびMdTST2 (c) の発現を制御します。 d、MdTST1/2 プロモーターの ABRE エレメント分析。 e、MdERDL6-1 トランスジェニックリンゴの RNA 配列における 3 つの異なる転写因子の qRT-PCR 検証。転写レベルは、トランスジェニックリンゴの MdActin のレベルで正規化されました。各遺伝子の相対発現レベルは、野生型 (WT) での発現を「1」として、ddCT 法によって得られました。バーは平均値 ± SD (n = 3 実生) を表します。 (e) のアスタリスクは、スチューデントの t 検定 (両側) によって評価された有意差を示します。 ***P < 0.001、**P < 0.01、ns、有意ではありません。

ソースデータ

a、b、MdSnRK2.3 および MdAREB1.1/1.2 の発現レベルに対する糖摂取の影響。リンゴカルスを、2%の異なる外因性糖(対照として水を使用)および異なる濃度のGlcを含むMS液体培地で24時間培養し、遺伝子発現レベルをqRT-PCRによって検出した。転写レベルは、MdActin のレベルで正規化されました。相対的発現レベルは、給水時の発現レベルを「1」として設定し、ddCT法によって得た。 c、d、MdAREB1.1/1.2プロモーター活性に対する糖摂取の影響。リンゴカルスを、MdAREB1.1/1.2pro-GUS プラスミドを保持するアグロバクテリウムで浸潤した後、さまざまな外因性糖およびさまざまな濃度の Glc を含む MS 液体培地で 24 時間培養しました。処理リンゴカルスと対照リンゴカルスを、24 時間給餌した後、GUS 活性アッセイのために収穫しました。 MdAREB1.1 および MdAREB1.2 の 1924 bp および 1937 bp プロモーターを GUS 実験で使用しました。男性: マンノース; Glc：グルコース。 Fru: フルクトース。 Suc:スクロース; ソル：ソルビトール。バーは平均値 ± SD (n = 3 の独立した生物学的複製) を表します。異なる文字は、それぞれ一元配置分散分析 (テューキー検定) によって評価された有意差を示します (P < 0.05)。

ソースデータ

a、リンゴ由来の MdAREB とシロイヌナズナおよびトマト由来のオルソロガス遺伝子の系統樹。 AREBオルソロガス配列を収集し、MEGA7ソフトウェアの隣接結合法を使用して根のない系統樹を構築しました。系統樹トポロジーの信頼できる推定値を提供するために、ブートストラップ分析の 1000 回の試行が使用されました。色付きの丸がこの研究で研究される遺伝子です。スケールバーは 0.05 に対応します。 b、MdAREB1.1/1.2の核局在。 35Spro:MdAREB1.1/1.2-GFP はシロイヌナズナの葉のプロトプラストで一過的に発現されました。 DAPI は核色素として機能しました。 MdAREB1.1/1.2のGFPシグナルはDAPIと重なり、MdAREB1.1/1.2が核内に局在していることが示された。スケールバー、20μm。 c、MdAREB1.1/1.2の転写自己活性化アッセイ。 pGBKT7-MdAREB1.1/1.2および空のpGBKT7ベクター（ネガティブコントロール）をそれぞれ酵母株Y2Hに導入し、形質転換細胞をSD-TrpおよびSD-Trp-His-Leu+x-α-Gal培地にスポットしました。。プレートを30℃で3日間インキュベートしました。 d、成熟した葉（ML）および発育中の果実の5段階（S1〜S5）におけるRNA配列に基づくMdAREB発現レベルのヒートマップ。倍率差は、S1 のデータを 1 に設定した log2 値として指定されます。(b、c) の実験は独立して少なくとも 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。

ソースデータ

a、MdAREB1.1 または MdAREB1.2 の完全なコード配列は、遺伝子の安定した過剰発現のために pMDC83 ベクターに挿入されました (OE-MdAREB1.1#1、#2; OE-MdAREB1.2#1、#2)。遺伝子安定サイレンシングのために、特定の cDNA 断片を pK7GWIWG2 ベクターにクローニングしました (PK7-MdAREB1.1#1、#2; PK7-MdAREB1.2#1、#2)。空のベクターpMDC83およびPK7はそれぞれ対照として機能した。 b、pMDC83からの値を「1」として設定した、トランスジェニックリンゴカルスにおけるMdAREB1.1/1.2およびMdTST1/2のmRNA相対発現レベル。 c、トランスジェニックリンゴカルス中の糖濃度（Fru、フルクトース、Glc、グルコース、Suc、スクロース）。バーは平均値 ± SD (n = 3 の独立した生物学的複製) を表します。異なる文字は、一元配置分散分析 (テューキー検定) によって評価された有意差を示します (P < 0.05)。

ソースデータ

a、リンゴの MdSnRK2 とシロイヌナズナおよびトマトのオルソロガス遺伝子の系統解析。 SnRK2s オルソロガス配列を収集し、MEGA7 ソフトウェアの隣接結合法を使用して根のない系統樹を構築しました。明らかに 3 つのサブクラスにクラスター化されました。系統樹トポロジーの信頼できる推定値を提供するために、ブートストラップ分析の 1000 回の試行が使用されました。色付きの丸がこの研究で研究される遺伝子です。スケールバーは 0.05 に対応します。 b、MdERDL6-1を過剰発現するリンゴ系統におけるRNA配列に基づくMdSnRK2s発現レベルのヒートマップ。倍率差は、WT のデータを 1 に設定した log2 値として指定されます。 c、MdSnRK2.1/2.3/2.5 のタンパク質存在量 (定量化されたタンパク質) は、5 つの発達段階のタンデム質量タグ (TMT) 定量的プロテオミクスから抽出されます。のリンゴの果実。バーは平均値 ± SD (n = 3 の独立した生物学的複製) を表します。 d、シロイヌナズナの葉からのプロトプラストにおけるMdSnRK2.3-GFP融合タンパク質の細胞内局在。 GFP、緑色蛍光タンパク質。 DAPI (4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール) を使用して核を染色しました。 Auto、葉緑体の赤色の自動蛍光。バー = 20 μm。 (d) の実験は独立して少なくとも 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。

ソースデータ

a、b、酵母ワンハイブリッドアッセイは、MdAREB1.1/1.2およびSlAREB1.2がABREシスエレメントを含む独自のプロモーターに結合することを示した。 ABRE cis エレメントを含むまたは含まない P1 および P2 トランケーションプロモーターの概略図。縦線は ABRE cis エレメントを表します (a)。陽性対照は、pAbAi-P53 および pGADT7-53 でした。 AbA のスクリーニング濃度は、MdAREB1.1、MdAREB1.2、および SlAREB1.2 プロモーターのそれぞれ 150 ng/mL、180 ng/mL、および 200 ng/mL でした。各コロニーを5μLの滅菌NaClに溶解し、次いで10-1〜10-3に希釈した。 c. タバコ (N. benthamiana) の葉におけるデュアルルシフェラーゼアッセイにより、MdAREB1.1/1.2 および SlAREB1.2 がそれぞれのプロモーターに結合していることが明らかになりました。左はデュアルルシフェラーゼシグナルイメージング、右はデュアルルシフェラーゼ活性アッセイです。 MdAREB1.1およびMdAREB1.2の1924bpおよび1937bpプロモーター、SlAREB1.2の1911bpプロモーターをこのアッセイで使用した。ポジティブコントロールは、pGreenII 0800-LUC-P53 および pGreenII 62-SK-53 です。実験は独立して少なくとも 3 回繰り返され、同様の結果が得られました。

ａ、トランスジェニックトマト系統の果実（過剰発現系統：ＯＥ＃２、ＯＥ＃５；沈黙系統：ＰＫ７＃１、ＰＫ７＃３）。 b、c、トランスジェニックトマトにおけるSlAREB1.2およびSlTST1/2の相対発現レベルは、qRT-PCRを使用して測定され、WTからの値を「1」としてSlActinの発現レベルに正規化されました。 d、e、トランスジェニックトマトの成熟した果実中の可溶性固形分含量と炭水化物レベル。 Glc、グルコース。 Fru、フルクトース。なるほど、スクロース。バーは平均値 ± SD (n = 3 の独立した生物学的複製) を表します。アスタリスクは、スチューデントの t 検定 (両側) によって評価された有意差を示します。 ***P < 0.001、**P < 0.01、*P < 0.05。

ソースデータ

a、得られたベクターpTRV2-SlAREB1.2およびpTRV1を含むアグロバクテリウムを等しい割合で混合し、これらを2つのMdERDL6-1過剰発現トマト系統(OE1-pTRV#SlAREB1.2およびOE2-pTRV#SlAREB1.2)への注射に使用した。 )、対照として注射用の空の pTRV2 および pTRV1 混合物 (WT、OE-1、および OE-2)。矢印は果物の注射部位を示します。 b、野生型およびMdERDL6-1過剰発現バックグラウンドのトランスジェニックトマト果実におけるSlAREB1.2およびSlTST1/2のmRNA相対発現レベル。WTからの値を「1」と設定。 c、野生型およびMdERDL6-1過剰発現バックグラウンドのトランスジェニックトマト果実における糖濃度(Fru、フルクトース; Glc、グルコース; Suc、スクロース)。バーは平均値 ± SD (n = 3 の独立した生物学的複製) を表します。異なる文字は、一元配置分散分析 (テューキー検定) によって評価された有意差を示します (P < 0.05)。

ソースデータ

a、得られたベクターpTRV2-SlSnRK2.3およびpTRV1を含むアグロバクテリウムを等しい割合で混合し、これらを2つのMdERDL6-1過剰発現トマト系統(OE1-pTRV#SlSnRK2.3およびOE2-pTRV#SlSnRK2.3)への注射に使用した。 )、対照として注射用の空の pTRV2 および pTRV1 混合物 (WT、OE-1、および OE-2)。矢印は果物の注射部位を示します。 b、野生型およびMdERDL6-1過剰発現バックグラウンドのトランスジェニックトマト果実におけるSlSnRK2.3、SlAREB1.2およびSlTST1/2のmRNA相対発現レベル（WTからの値を「1」と設定）。 c、野生型およびMdERDL6-1過剰発現バックグラウンドのトランスジェニックトマト果実における糖濃度(Fru、フルクトース; Glc、グルコース; Suc、スクロース)。バーは平均値 ± SD (n = 3 の独立した生物学的複製) を表します。異なる文字は、一元配置分散分析 (テューキー検定) によって評価された有意差を示します (P < 0.05)。

ソースデータ

補足図。 1 ～ 9 および表 1 ～ 6。

統計ソースデータと未処理のウェスタンブロット。

統計ソースデータ。

未処理のウェスタンブロット。

未処理のウェスタンブロットおよびゲル。

統計ソースデータ。

統計ソースデータと未処理のウェスタンブロット。

統計ソースデータ。

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転載と許可

Zhu、L.、Li、Y.、Wang、C. 他。細胞質グルコースによって活性化される SnRK2.3-AREB1-TST1/2 カスケードは、リンゴとトマトの液液細胞全体にわたる糖の蓄積を調節します。ナット。植物 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41477-023-01443-8

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受信日: 2022 年 12 月 9 日

受理日: 2023 年 5 月 12 日

公開日: 2023 年 6 月 8 日

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